雌二醇調控VEGFα表達誘導肺腺癌A549細胞血管形成

任祥春，季 爽，張文英，費廣鶴

(安徽醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，安徽 合肥 230022)

肺癌是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，中國女性的肺癌發病率僅次于乳腺癌，位于第2位，但死亡率遠高于乳腺癌，位于第1位[1]。男性和女性肺癌患者的發病特點不同，女性以非吸煙者居多，腺癌居多[2-3]。這種由性別差異造成的肺癌發病率不同，歸因于內源性激素的差異[2]。雌激素是一種類固醇性激素，通過和受體結合發揮作用。雌激素受體主要包括雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)和雌激素受體β(estrogen receptor β，ERβ)，其中ERβ是雌激素在肺部發揮生理效應的主要介導受體[4]。本課題組前期研究結果也表明，ERβ在絕經前女性肺腺癌患者癌組織中高表達[5]，但具體的發病機制仍不清楚。血管內皮生長因子α(vascular endothelial growth factor α，VEGFα)是一種特異性較高，誘導腫瘤血管生成較強的調節因子，通過增加血管內皮的有絲分裂，促進血管內皮細胞遷移，重塑細胞外基質，增加血管通透性，與肺癌的發生、發展和轉移密切相關[6-7]。本文旨在探討雌激素調控肺腺癌A549細胞中VEGFα，誘導肺血管生成的發病機制，為深入研究靶向抑制藥物和肺腺癌的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株人肺腺癌A549細胞、人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，購自上海復旦大學細胞庫。

1.2 試劑與儀器RPMI 1640、DMEM細胞培養基，購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，購自Gibco公司；基質膠，購自Corning公司;兔源性VEGFα和β-actin抗體，購自CST公司；MTT、胰酶消化液，購自上海碧云天生物技術有限公司；ELISA試劑盒，購自北京博凌科為生物科技有限公司；雌二醇(17β-estradiol,E2)，購自Sigma公司；雌激素受體拮抗劑ICI)，購自MCE公司。酶標儀、細胞培養箱(美國賽默飛公司)；超凈工作臺(蘇州金燕凈化設備有限公司)；低速離心機(德國Eppendorf公司)；倒置顯微鏡與照像系統(日本Nikon公司)；電泳儀、轉印儀(美國伯樂公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養與傳代 將凍存的A549細胞和HUVEC細胞立即放入37 ℃溫水中快速搖晃，直至融化，分別接種于含10% FBS的RPMI 1640培養液和含10% FBS的DMEM培養液中，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，隔日觀察，棄去培養液，PBS洗3次，換取新的培養液。待細胞貼壁生長至培養皿的85%～90%時，棄去培養液，PBS清洗后，取1 mL的胰蛋白酶放入培養皿中，置于5% CO2細胞培養箱中消化2～3 min，顯微鏡下觀察細胞消化情況，待細胞回縮變圓時，再分別用含10% FBS的RPMI 1640和含10% FBS的DMEM培養液輕輕吹打后重懸、離心，棄去上層液，用含10% FBS的培養液重懸，按1 ∶3比例傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2Western blot 收集PBS組、10 nmol·L-1E2組、10 nmol·L-1E2+5 μmol·L-1雌激素受體抑制劑ICI組的A549細胞，提取蛋白，定量后，進行SDS-PAGE電泳；然后將蛋白從凝膠轉移到PVDF膜；用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別加VEGFα和β-actin的一抗 (1 ∶1 000稀釋) 4 ℃過夜；次日，PBST洗膜，添加對應的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯影，記錄分析實驗結果。

1.3.3酶聯免疫吸附實驗(ELISA) ELISA法檢測A549細胞培養基中VEGFα水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4MTT實驗 本實驗分為PBS組、10 nmol·L-1E2組、10 nmol·L-1E2+5 μmol·L-1ICI三組，分別評估HUVEC細胞增殖活力。收集HUVEC對數期細胞，調整細胞密度為3×104個每孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。5% CO2、37 ℃孵育至細胞貼壁，次日分別加入PBS、E2、E2+ICI預處理后的A549細胞培養基，設4個復孔，5% CO2、37 ℃孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，繼續培養4 h，棄去孔中的MTT溶液，然后加入150 μL DMSO，置搖床上低速搖晃10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀490 nm處測定吸光度OD值，計算樣品濃度。

1.3.5劃痕實驗 將A549細胞分為3組，分別給予PBS、10 nmol·L-1E2、10 nmol·L-1E2+5 μmol·L-1ICI預處理，取5×105的HUVEC細胞接種于6孔板中培養，待其處于對數生長期時，使用20 μL的槍頭在單層細胞表面劃痕，PBS漂洗2次，再加入3組培養基繼續培養24 h，分別在劃痕后0、24 h拍照，觀察細胞的相對遷移距離。使用ImageJ軟件計算細胞遷移距離，遷移距離=(遷移前兩側細胞間距-遷移后兩側細胞間距)。

1.3.6小管生成實驗 A549細胞分組同“1.3.5”。在96孔板上預先鋪基質膠每孔50 μL，置于37 ℃孵箱中放置1 h凝固后，按50 000個/孔接種HUVEC細胞，分別加入3組A549細胞培養上清，37 ℃培養24 h后拍照記錄，使用ImageJ軟件計算小管形成長度。

2 結果

2.1 E2和雌激素受體拮抗劑ICI影響A549細胞中VEGFα的表達如Fig 1A所示，與PBS組相比，E2組A549細胞中VEGFα蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)；與E2組相比，E2+ICI組細胞中VEGFα蛋白表達明顯降低(P<0.01)。采用ELISA法檢測各組細胞培養上清中VEGFα的表達，趨勢和Western blot檢測VEGFα的蛋白表達一致(Fig 1B)。

Fig 1 Expression of VEGFα in A549 cells affected by E2 and ICI n=3)

A: Western blot analysis for VEGFα in A549 cells; B: ELISA analysis for VEGFα in A549 culture media.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vsE2 group.

2.2 E2和ICI作用的A549細胞上清對HUVEC細胞增殖能力的影響如Fig 2所示，與PBS組相比，E2組中HUVEC細胞的增殖能力明顯升高(P<0.01)；與E2組相比，E2+ICI組HUVEC細胞的增殖能力明顯降低(P<0.05)。

Fig 2 Cell proliferation of HUVECs cultured with A549 conditioned media by MTT n=3)

**P<0.01vsPBS group;#P<0.05vsE2 group

2.3 E2和ICI作用的A549細胞上清對HUVEC細胞遷移能力的影響Fig 3結果顯示，是否添加VEGFα抗體，對HUVEC細胞的遷移距離有影響。未添加VEGFα抗體組中，與PBS組相比，E2組的細胞遷移距離明顯增加(P<0.01)；與E2組比較，E2+ICI組的細胞遷移距離明顯減小(P<0.01)。加入VEGFα抗體組中，PBS組、E2組、E2+ICI組的3組間遷移距離差異無統計學意義。

A: HUVEC was cultured with A549 conditioned media without VEGFα antibody; B: HUVEC was cultured with A549 conditioned media with VEGFα antibody; C: The migration distance was analyzed.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vsE2 group.

2.4 E2和ICI作用的A549細胞上清對HUVEC細胞小管形成能力的影響Fig 4結果顯示，是否加入VEGFα抗體，對HUVEC細胞的小管形成長度有影響。在未添加VEGFα抗體的組中，與PBS組比較，E2組的小管生成長度增加(P<0.01)；與E2組相比，E2+ICI組的小管生成長度減小(P<0.01)。在添加VEGF抗體的組中，PBS組、E2組和E2+ICI組，3組間的小管生成長度差異無統計學意義。

A: HUVEC was cultured with A549 conditioned media without VEGFα antibody. The tube formation length was calculated 24 h later. B: HUVEC was cultured with A549 conditioned media with VEGFα antibody.The tube formation length was calculated 24 h later.C: The tube formation length was analyzed by ImageJ.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vsE2 group.

3 討論

近年來，肺腺癌在無吸煙史的女性患者中發病率不斷升高，但具體的發病機制仍不清楚，可能與女性內源性的性激素有關。本課題組的前期研究表明，與絕經后女性相比，絕經前女性肺腺癌患者癌組織中ERβ表達水平明顯升高[5]。本實驗在前期研究的基礎上，進一步深入探討雌激素和肺腺癌的關系。結果表明，E2和肺腺癌A549細胞中雌激素受體ERβ結合后，VEGFα的表達增加，促進了HUVEC細胞的增殖、遷移和小管形成；加入VEGFα抗體后，明顯抑制了HUVEC細胞的遷移和小管形成。既往研究指出，在直徑超過2 mm的實體腫瘤中，肺部腫瘤微環境中的血管形成，在肺癌細胞的生長、黏附、轉移和侵襲中起主導作用[7-8]。由此可見，VEGFα在肺腺癌A549細胞的血管微環境形成中發揮重要作用。國內文獻指出，乳腺癌中有70%～80%為雌激素受體陽性乳腺癌[9]，所以在乳腺癌中關于此方面的研究較多，大量研究也支持我們的實驗結果：E2通過和G蛋白偶聯受體GPR30(GPER)結合，激活HIF-1α/VEGF信號通路，促進了乳腺癌腫瘤血管的形成[10-12]。在甲狀腺癌中，E2通過激活PI3K/Akt信號通路，使VEGFα的表達量增加[13]。同時本實驗結果還表明，雌激素受體拮抗劑ICI發揮抑制E2的促腫瘤微血管形成的作用。在肺癌的靶向治療中，既往對經典的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)靶點研究較多，但其突變率較低，服藥后期的耐藥率較高。因而，近年來在非小細胞肺癌靶向治療中，采用酪氨酸激酶抑制劑聯合雌激素受體抑制劑ICI，可有效增強抗腫瘤作用[14]，但是在女性肺腺癌中缺少此方面的深入研究。本研究結果為女性肺腺癌的靶向精準治療提供了理論依據。

綜上所述，在肺腺癌A549細胞中，雌激素可能是通過和高親和性的雌激素受體ERβ結合，增加了VEGFα的表達，促進肺腺癌血管內皮的增殖、遷移和小管形成能力；雌激素受體拮抗劑ICI和VEGFα抗體的作用相反。本實驗的研究結果進一步證實了雌激素通過調控VEGFα的表達，在肺腺癌微血管形成中的重要作用，為臨床治療提供新思路。

(本實驗是在安徽醫科大學安徽省人獸共患病重點實驗室完成，感謝沈繼龍老師及其團隊所給予的支持和幫助)