基于 1H NMR代謝組學技術探討黨參不同炮制品對免疫抑制大鼠的影響

郝艷艷，聶春霞，何 盼，武曉偉，劉 聰，郝旭亮

(1. 山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，山西 太原 030045；2. 山西省中醫(yī)藥大學中藥學院，山西 太原 030619)

黨參是桔梗科植物Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.川黨參CodonopsistangshenOliv.和素花黨參CodonopsispilosulaNannf var.modesta(Nannf.)L. T. Shen的干燥根[1]。具補中益氣、健脾益肺的作用，是中醫(yī)常用補氣藥。作為補益類中藥材，黨參在機體免疫調(diào)節(jié)方面的研究廣泛而深入。張曉君等[2]發(fā)現(xiàn)，黨參多糖對體液免疫有較強促進作用。張雅君等[3]的研究也發(fā)現(xiàn)，黨參粗多糖提取液可促進小鼠脾臟B淋巴細胞的增殖，提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力，進而調(diào)整機體免疫功能。

歷代中醫(yī)家對黨參炮制也較為重視，通過輔料或不同炮制方法讓黨參的功效也各有不同。如米炒后的黨參健脾的作用增強，蜜炙后的黨參益氣作用增強[4]，酒炙和蜜炙可升高黨參的多糖含量，米炒、麩炒可使黨參多糖含量降低[5]。楊中林等[6]研究黨參不同炮制品時發(fā)現(xiàn)：在提高小鼠巨噬細胞吞噬能力方面，蜜炙黨參優(yōu)于米炒黨參和生黨參，初步證明臨床補氣用傳統(tǒng)的蜜炙法炮制品為佳。本文利用代謝組學技術，旨在進一步明確黨參不同炮制品對環(huán)磷酰胺(cylophosphamide，CTX)所致免疫抑制大鼠的影響，并深入研究其作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑黨參飲片(批號：20180104)、米炒黨參飲片(批號：20180110)、蜜炙黨參飲片(批號：20180101)，由山西振東集團提供，均為潞黨參及其炮制品。氯化鈉注射液(杭州民生藥業(yè)集團有限公司)；CTX(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號：18022125)；IL-2 ELISA試劑盒、免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA試劑盒，均購自美國ADL公司；氘代重水(D2O)，購自美國Sigma-aldrich公司。

1.2 儀器KDC-2046高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司)；HEMAVET 950FS全自動血液分析儀(美國Drew Scientific公司)；貝克曼流式細胞儀Cytomics FC 500(COULTER TQ-Prep工作站)；Synergy H1酶標儀(BioTek公司)；Bruker AVANCE III 600超導高分辨核磁共振譜儀(德國Bruker公司)。

1.3 樣品制備黨參及其各炮制品飲片60 ℃烘干，加8倍水煎煮3次，每次1 h，過濾，濾液濃縮至一定濃度，60 ℃常壓烘干，備用。

2 方法

2.1 動物分組及給藥50只SPF級SD大鼠，♀♂各半，體質量(180±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005。適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為5組，每組10只，♀♂各半，即空白對照組(NS)、模型組(MS)、黨參藥材(Cp，3.75 g·kg-1生藥)、蜜炙黨參(HCp，3.75 g·kg-1生藥)、米炒黨參(RCp，3.75 g·kg-1生藥)。各給藥組按每只大鼠10 mL·kg-1劑量灌胃相應藥物，空白對照組及模型組給予等體積生理鹽水；連續(xù)14 d，每天1次。給藥d 1起，除空白對照組外，各組均腹腔注射CTX(40 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)3 d，同時治療給藥。實驗前禁食(不禁水)12 h。最后1 d給藥1 h后，腹主動脈取血，一部分血置于抗凝管中；剩余血液置于EP管中，靜置1 h左右，3 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液，分裝，-20 ℃冰箱保存，備用。摘取十二指腸、空腸和回腸(各約3 cm)置于平皿中，縱行剖開，刮取腸黏膜黏液，收集于同一離心管。內(nèi)容物與生理鹽水按1 ∶1(W/V)稀釋，混勻后，3 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 指標檢測部分外周血用動物血球計數(shù)儀計數(shù)外周血細胞；剩余部分外周血用流式細胞儀檢測T細胞亞群CD4+、CD8+表達。采用ELISA法，分別檢測血清中IL-2、IgG的含量，ELISA法檢測腸道sIgA含量。

2.3 核磁樣品制備與測試將400 μL解凍的血清加入311 μL D2O，渦旋30 s，4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液600 μL于5 mm核磁管中進行核磁測試。采用Bruker 600 MHz AVANCE Ⅲ NMR譜儀采集數(shù)據(jù)，CPMG序列壓制水峰，掃描次數(shù)為64，譜寬12 345.7 Hz，圖譜大小65 536數(shù)據(jù)點，脈沖寬度(PW)=30°(12.7 us)，傅里葉變換LB=0.3 Hz，延遲時間為5.0 s。

2.41H NMR圖譜處理與分析采用MestReNova核磁圖譜處理軟件(version 8.0.1)對所有1H NMR圖譜進行手動相位和基線調(diào)整。所有圖譜以肌酸(δ 3.04)為標準進行化學位移、相位與基線校正，對δ 0.60～9.00區(qū)域的譜圖進行0.01等寬度分割積分，切除水峰δ 4.50～5.00。剩余積分數(shù)據(jù)歸一化后，運用SIMCA-P 13.0(Umetrics，瑞典)軟件進行多元統(tǒng)計分析。主成分分析(principal component analysis，PCA)反映的是樣本內(nèi)部固有的差異性和相似性，以顯示數(shù)據(jù)的原始分類狀態(tài)，進一步進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)，用排列實驗(permutation tests，200次)來驗證PLS-DA的有效性。結合OPLS-DA的VIP值和相應的s-plot圖，尋找組間的差異代謝產(chǎn)物。

3 結果

3.1 免疫細胞結果Tab 1結果表明，與對照組相比，模型組白細胞總數(shù)、B淋巴細胞數(shù)及T細胞常數(shù)，結合BMRB(Biological Magnetic Resonance Data Bank, http://www.bmrb.wisc.edu/)數(shù)據(jù)庫，以及文獻[7-9]中數(shù)據(jù)對圖譜進行指認，在大鼠血清中共指認出32種代謝產(chǎn)物，包含大量的氨基酸、碳水化合物、有機酸等，結果見Tab 3(Fig 1中標號與Tab 3相對應)。

Fig 1 Typical 1H NMR spectrum of serum from rats

Tab 1 Effect of Codonopsis pilosula and its differentprocessed products on counts of

**P<0.01vsNS;#P<0.05,##P<0.01vsMS

CD4+/CD8+值明顯降低(P<0.01)，說明免疫低下模型復制成功；給藥后，黨參組(P<0.01)、蜜炙組(P<0.01)和米炒組(P<0.05)均有明顯升高，說明3組炮制品均可明顯提高機體免疫細胞水平。

3.2 免疫因子結果Tab 2結果顯示，與對照組相比，模型組各免疫因子含量明顯降低(P<0.01)；給藥后，黨參組(P<0.05)、米炒黨參組(P<0.01)、蜜炙黨參組(P<0.01)對IL-2均有明顯回調(diào)作用；黨參組對IgG有升高作用(P<0.01)，米炒黨參組和蜜炙黨參組則沒有變化；對于sIgA，只有蜜炙組對其有回調(diào)作用(P<0.05)，米炒組和黨參組沒有變化。

3.3 黨參不同炮制品對免疫抑制大鼠血清的代謝組學結果

3.3.1血清1H NMR圖譜的指認與分析 大鼠血清的核磁圖譜見Fig 1。根據(jù)化學位移、峰形、偶合為了進一步分析模型組與空白組之間的差異，首先采用PCA散點圖(Fig 3A)觀察兩組樣本的分離趨勢，可以看出模型組與空白組明顯分離；進一步采用PLS-DA分析(Fig 3B)，并在PLS-DA模型成立的基礎上，對原始數(shù)據(jù)建立排列實驗，表明隨機變量Y變量產(chǎn)生的R2、Q2均小于原始值(Fig 3C，R2=纈氨酸、醋酸、葡萄糖、丙酮酸含量降低；異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰0.995，Q2=0.875)，證明模型有效可靠。通過S-plot(Fig 3D)結合VIP值，進行獨立樣本t檢驗(P<0.05)尋找差異代謝物，得到14個具有顯著性差異的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。與空白對照組相比，模型組中糖蛋白、O-乙酰糖蛋白、甘油磷酰膽堿(GPC)、鯊肌醇含量升高。所有差異代謝物在各組中的含量分布見Fig 4，結果表明，蜜炙黨參組基本對所有差異代謝物均有明顯回調(diào)作用，黨參組和米炒黨參組對個別代謝物有明顯回調(diào)作用。

Tab 2 Effects of different processed products of

*P<0.05,**P<0.01vsNS;#P<0.05,##P<0.01vsMS

3.3.2多元統(tǒng)計分析 由于NMR圖譜反映的信息較多，很難直觀地反映出各組之間的差異，因此借助多元統(tǒng)計分析做進一步的分析。采用PCA 3D散點圖對所有樣本進行分析, 以顯示數(shù)據(jù)的原始分類狀態(tài)(Fig 2)，可以看出對照組與模型組明顯分離，表明模型復制成功；黨參組在三維空間里更接近于模型組，而蜜炙黨參組和米炒組與模型組明顯分開，說明蜜炙黨參組和米炒組與模型組差異較大；其中蜜炙黨參組與模型組相距最遠，提示蜜炙黨參組具有明顯回調(diào)作用。

Tab 3 1H NMR assignments of major metabolites from serum of rats

PC: Phosphatidylcholine; GPC: Glycerophosphocholine; TMAO: Trimethylamine oxide; m: multiple peaks; s: single peak; d: double peaks; t: triple peaks; J: coupling constant.

Fig 2 PCA 3D score plot of rat serum among all groups

3.3.3代謝通路分析 將找到的差異代謝物輸入www.metaboanalyst.cn進行Met PA分析，將Pathway Impact>0.1的代謝途徑列為最重要的代謝途徑，得到與免疫低下模型相關的代謝通路如Fig 5所示。

Fig 3 PCA score plot(A),PLS-DA score plot(B),correspondingvalidation(C),and S-plot(D) from serum of rat between control and model groups

4 討論

4.1 免疫細胞結果分析白細胞是體內(nèi)防御系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量的減少代表著機體免疫功能低下[10]。B淋巴細胞是體液和細胞免疫的重要組成部分，能夠通過多種調(diào)控方式發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)作用。T細胞在免疫應答過程中發(fā)揮中樞的作用，CD4+T細胞具有輔助細胞免疫和體液免疫應答的作用，CD8+T細胞則是重要的效應細胞，兩者的比值可以反映機體免疫功能水平。給藥后，黨參組及各炮制品組均可明顯升高模型大鼠白細胞、B淋巴細胞及T細胞CD4+/CD8+值水平。與米炒黨參相比，黨參組和蜜炙黨參組在改善CTX引起的白細胞及淋巴細胞數(shù)減少方面效果更好。各給藥組在提高T細胞CD4+/CD8+值方面效果相當。

4.2 免疫因子結果分析sIgA是構成腸道黏膜免疫的重要組成成分，也是維持其穩(wěn)態(tài)的第一道防線。IL-2是重要的免疫調(diào)控因子，可直接增強T細胞介導的細胞免疫功能，能促進T細胞生長、增殖、分化及抗體形成[11]等。IL-2也可直接活化B細胞，使其生長并刺激抗體產(chǎn)生，故也是一種B細胞生長因子，促進B細胞介導的體液免疫[12]。IgG是免疫系統(tǒng)重要的組成部分，其含量一定程度上反映了機體免疫功能的強弱。給藥后，黨參可明顯提高IL-2、IgG水平；蜜炙黨參明顯改善免疫抑制引起的IL-2、sIgG含量降低；米炒黨參升高模型大鼠IgG水平明顯。

4.3 代謝通路分析亮氨酸、異亮氨酸，是蛋白質和葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)器[13]，也是維持淋巴細胞敏感性與免疫細胞功能所必需的功能物質。纈氨酸屬生糖氨基酸，可促進糖異生，還能通過影響免疫球蛋白的合成來影響免疫功能[14]。本實驗中，米炒組、蜜炙組纈氨酸含量升高，說明給予其可促進機體葡萄糖的生成，產(chǎn)生更多能量，同時合成免疫球蛋白，提高機體免疫力；蜜炙黨參組亮氨酸、異亮氨酸含量降低，說明蜜炙組促進其代謝，維持機體各免疫細胞的功能，從而增強機體免疫力。

谷氨酸、谷氨酰胺是淋巴細胞和中性粒細胞等快速分裂的主要能源物質，在其代謝過程中起氮的載體和供體作用，可間接提高白細胞與淋巴細胞的增殖，改善機體免疫作用[15]。給藥后，谷氨酸、谷氨酰胺含量降低，推測谷氨酸、谷氨酰胺不斷快速代謝，從而加速淋巴細胞增殖，提高機體免疫力，這一變化與免疫細胞結果相一致。

丙氨酸和谷氨酸是體內(nèi)重要氨基酸，通過氨基轉移酶在體內(nèi)相互轉化。丙氨酸是肝臟合成葡萄糖的主要底物，影響白細胞的合成，進而影響機體免疫功能。有研究表明，在B淋巴細胞雜交瘤中添加2 mmol·L-1的丙氨酸可以防止細胞凋亡、促進細胞生長以及刺激抗體的產(chǎn)生[16]。模型組大鼠血清丙氨酸及谷氨酸含量升高，表明CTX引起機體丙氨酸和谷氨酸的蓄積，利用率明顯降低，從而造成免疫抑制。黨參各炮制品治療后，丙氨酸和谷氨酸水平均有向對照組回調(diào)的趨勢，其中以蜜炙黨參組效果最明顯，表明黨參可以促進丙氨酸和谷氨酸的代謝，從而修復機體免疫功能缺陷。

葡萄糖、丙酮酸是糖代謝中重要能源物質，機體進行有氧代謝時，葡萄糖生成丙酮酸后，進入三羧酸循環(huán)，保證機體正常供能。本實驗中，蜜炙黨參組葡萄糖和丙酮酸含量高于模型組，說明免疫低下模型大鼠的糖代謝以無氧代謝為主，而黨參組以有氧代謝為主，從而提高機體供能水平。

Fig 5 MetPA analysis of metabolic pathway

1:Valine, leucine, isoleucine metabolism; 2: Glutamate, glutamine metabolism; 3: Alanine, asparticacid, glutamicate metabolism.

GPC參與細胞膜對蛋白質的識別和信號轉導，可調(diào)節(jié)細胞膜的流動性，屬脂質代謝的中間體。本實驗中，蜜炙黨參組GPC含量降低，說明蜜炙黨參可以改善CTX誘導的細胞膜的損傷，維持免疫細胞的結構和功能。

乙酰糖蛋白作為炎癥反應的急性期反應蛋白[17]，在機體受到刺激發(fā)生炎癥反應后含量升高[18]。本研究中，蜜炙黨參組O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白含量低于模型組，表明CTX誘導免疫低下大鼠的炎癥反應發(fā)生，蜜炙黨參可促使機體免疫反應恢復，免疫力趨于正常。

本研究基于1H NMR代謝組學技術，對比了黨參及其不同炮制品(米炒黨參、蜜炙黨參)對免疫抑制大鼠的影響。結果表明，對于CTX所致的免疫低下大鼠，蜜炙黨參改善效果優(yōu)于黨參和米炒黨參，表現(xiàn)在明顯提高大鼠血清中白細胞、淋巴細胞及CD4+/CD8+值、IL-2、sIgA的含量，明顯回調(diào)血清中12個內(nèi)源性代謝物的水平，主要通過纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸代謝，谷氨酸、谷氨酰胺代謝以及丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝3條通路，以及其他物質(如葡萄糖、丙酮酸、GPC以及乙酰糖蛋白)的代謝來發(fā)揮免疫作用。該研究結果為黨參藥效物質基礎研究及其不同炮制品的臨床精準化使用提供了理論依據(jù)。