富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白保護脂多糖誘導的大鼠腸上皮細胞IEC6損傷

徐莉莎，朱家楨，馮黎黎，吳旭東

(南京大學生命科學學院醫藥生物技術國家重點實驗室，江蘇 南京 210023)

腸上皮細胞屏障功能喪失與很多疾病相關，并會導致全身免疫系統激活，促進慢性病毒感染進展及代謝性疾病。盡管腸道通透性在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、I型糖尿病、乳糜瀉等疾病中占據著非常重要的位置，但是在實際治療或干預中并未得到足夠的重視。恢復腸道通透性是治療這類疾病的一種主要手段，目前應用的藥物有抗TNF-α的單克隆抗體英孚利昔單抗(Infliximab)，它能在治療糖皮質激素抵抗的克羅恩病(Crohn's disease，CD)時，恢復腸通透性和上皮屏障功能[1]。除此之外，用于治療腸道疾病的在研藥物還包括生長因子、益生菌、抑制NF-κB信號通路的藥物[2]、肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)抑制劑[3]和蛋白酶激活受體-2(protease-activated receptor-2，PAR2)拮抗劑[4]等。

尋找合適的藥物及治療方法保護腸上皮細胞，增強腸上皮細胞緊密連接，對于改善上述疾病至關重要。腸道菌群在很多疾病的發生、發展過程中起到關鍵作用，衰老、高血壓、糖尿病、慢性肝臟疾病及腸道疾病如IBD等，都與腸道菌群有關。硒是一種重要的微量元素，能以無機或有機的形式存在，硒摻入蛋白質中可形成硒代胱氨酸。飲食中增加硒能夠通過減少氧化應激，來緩解熱應激所導致的豬腸上皮屏障受損[5]。富硒益生菌綜合了微量元素硒和益生菌的優勢，改善♂小鼠繁殖能力[6]；改善小豬對高溫環境的適應性、調節腸道菌群，改善免疫功能及抗氧化狀態[7]；改善高脂飲食導致的小鼠脂代謝紊亂及肝損傷[8]。對于富硒長雙歧桿菌影響腸上皮細胞的研究還較少，本研究擬通過研究富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白對腸上皮細胞的保護作用，探討其保護腸上皮細胞的機制，以闡明富硒長雙歧桿菌對腸道疾病潛在的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器富硒長雙歧桿菌(菌號：DD98)、水溶性蛋白樣品(批號：20170609)，由江蘇德禧生物科技有限公司提供；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、MTT、凋亡檢測試劑盒，購自Sigma-Aldrich公司；JC-1，購自Thermo Fisher公司；qPCR試劑盒，購自Bio-Rad公司；其余試劑為市售分析純。Sunrise Touchscreen Scanning酶聯免疫檢測儀(TECAN公司)；BD FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)；ABI 7300定量PCR儀(ThermoFisher公司)。

1.2 細胞株大鼠腸上皮細胞IEC6，購自中科院上海細胞所。用含10%新生牛血清的DMEM完全培養基，培養于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中。

1.3 方法

1.3.1制備富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白 取富硒雙歧桿菌菌體(約0.5 g)，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，超聲破碎(550 W，25 min)后，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清，加入100 U DNase和2.5 mg RNaseA，4 ℃靜置1 h，以消化核酸。隨后向上清中加入4倍體積冷丙酮，-20 ℃過夜沉淀蛋白。4 ℃、12 000×g離心5 min，棄上清，揮干丙酮，沉淀用蒸餾水重溶，得到富硒雙歧桿菌水溶蛋白溶液。凍干，-20 ℃保存備用。富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白中含硒量為1.23 mg·g-1，按照60 kg體重成人每日補充100～200 μg硒，則大鼠腸上皮細胞培養液中受試的富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白濃度應為30～60 mg·L-1。實驗中選擇10、30、100 mg·L-1進行檢測。低溫離心機購自艾本德中國有限公司。

1.3.2細胞活力檢測 將大鼠腸上皮細胞IEC6接種于96孔板中，用終濃度為50 mg·L-1LPS處理IEC6細胞，同時加入不同濃度的富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白孵育20 h后，加入終濃度為0.4 g·L-1的MTT繼續孵育4 h，96孔板1 000×g離心5 min，棄上清，每孔加入200 μL DMSO溶解沉淀，并于495 nm波長下測定吸光度。

1.3.3細胞凋亡檢測 用50 mg·L-1LPS處理IEC6細胞，同時加入不同濃度的富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白孵育24 h后，收集細胞，PBS洗滌兩遍，參照試劑盒說明書進行。用400 μL結合緩沖液重懸IEC6細胞，使用Annexin V-FITC和PI染色后，用流式細胞儀檢測。

1.3.4細胞線粒體膜電位檢測 用50 mg·L-1LPS和不同濃度的富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白處理IEC6細胞24 h，收集細胞，PBS洗滌兩遍，加入終濃度為5 mg·L-1的JC-1染料，染色15 min，用流式細胞儀檢測。

1.3.5Real-time PCR檢測 50 mg·L-1LPS和不同濃度的富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白與IEC6細胞共同孵育24 h，收集細胞，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA。擴增及定量使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix試劑盒，反應條件為：95 ℃ 5 min，40個下述循環95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，并作熔解曲線檢測擴增基因的特異性。結果表示為與陰性對照的變化倍數(以GAPDH作為參照基因進行標準化)。引物序列如下：ZO-1正向：5'-TTGGGACAGAGCCTATGGAACGG-3′，反向：5′-GAGCGAACTGAATGGTCTGATGC-3′； Occludin正向：5′-ACTGACTGGGTTTGGGCTAC-3′，反向：5′-TCACCAAGGAAGCGATGAAGCAA-3′；GAPDH正向：5′-TATGACTCTACCCACGGCAAGT-3′，反向：5′-ATACTCAGCACCAGCATCACC-3′。PCR儀購自Bio-Rad。

2 結果

2.1 富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白抑制LPS引起的IEC6細胞活力下降用50 mg·L-1LPS處理IEC6細胞，同時加入不同濃度的富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白，孵育24 h后，用MTT法檢測細胞活力。Fig 1結果顯示，LPS處理使細胞活力明顯下降，而不同濃度的富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白能夠明顯緩解LPS抑制細胞活力的作用。其中低、中、高濃度組均有效，但組間差異無顯著性。

Fig 1 Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum increased IEC6 cell viability n=5)

1：Control；2：LPS；3：LPS+Se 10 mg·L-1；4：LPS+Se 30 mg·L-1；5：LPS+Se 100 mg·L-1

Se: Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsLPS.

2.2 富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白減少LPS引起的IEC6細胞凋亡處理方法同上所述，Fig 2結果顯示，LPS處理下，IEC6細胞Annexin-V陽性及PI陽性的細胞比例明顯增加，而加入不同濃度的富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白，IEC6的細胞凋亡比例有所下降。

2.3 富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白緩解LPS引起的IEC6細胞線粒體膜電位倒塌細胞線粒體膜電位倒塌時，JC-1單體增加，聚合體減少，表現為FL2通道熒光強度下降。通過檢測JC-1聚合體熒光強度可以反映細胞線粒體膜電位水平。Fig 3結果顯示，富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白能夠抑制LPS引起的IEC6細胞JC-1聚合體熒光強度降低，表明富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白能夠抑制線粒體膜電位倒塌，保護IEC細胞線粒體功能。

Fig 2 Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum protected LPS-induced

1：Control；2：LPS；3：LPS+Se 10 mg·L-1；4：LPS+Se 30 mg·L-1；5：LPS+Se 100 mg·L-1.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsLPS

2.4 富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白抑制LPS引起的IEC6細胞緊密連接減少腸上皮細胞間的緊密連接決定了腸道內電解質及水分的平衡，其主要蛋白包括ZO-1和Occludin。因此，我們以ZO-1、Occludin mRNA的改變來判斷腸上皮細胞緊密連接的變化。如Fig 4所示，LPS刺激IEC6細胞后，導致ZO-1、Occludin mRNA水平降低，而富硒長雙歧桿菌水溶蛋白能夠抑制LPS的這種作用，升高ZO-1、Occludin的mRNA水平。

1：Control；2：LPS；3：LPS+Se 10 mg·L-1；4：LPS+Se 30 mg·L-1；5：LPS+Se 100 mg·L-1.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsLPS

3 討論

單層腸上皮細胞在機體和外部環境之間形成了一道物理和功能性的屏障，它們能調節營養物質的吸收、水及電解質的流動，并組成了抵御毒素和腸外病原體的第一道屏障。多種因素均可以導致該屏障的損害，造成腸上皮屏障功能紊亂，增加腸通透性，進而會誘發和加重炎性腸病。腸上皮細胞表面表達多種受體，可以與細胞因子結合，參與免疫級聯反應，加重炎癥反應，進而引發一系列疾患，如IBD、I型糖尿病、乳糜瀉。完整狀態的腸上皮屏障還可有效防止腸道病原菌的侵襲。鑒于腸上皮屏障在IBD中的重要作用，探索緩解上皮屏障功能紊亂的方法，是研究治療IBD的重要方向[9]。LPS可通過影響NF-κB、JNK信號[10]，調節COX2表達及PGE2生成[11]等作用，導致腸上皮細胞炎癥反應，因此，廣泛應用于腸上皮細胞的研究中[12, 13]。因為人Caco-2細胞株是來自人結腸癌細胞，其生物學特性不能完全反映原代腸上皮細胞的特征，IEC6更具有代表性，因此，我們采用大鼠腸上皮細胞株IEC6來研究富硒長雙歧桿菌對腸上皮細胞屏障的保護作用。

Fig 4 Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum protected decrease of LPS-induced IEC6 cell tight junction protein ZO-1 and Occludin mRNA levels n=5)

1：Control；2：LPS；3：LPS+Se 10 mg·L-1；4：LPS+Se 30 mg·L-1；5：LPS+Se 100 mg·L-1.##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsLPS

之前的研究表明，硒缺乏可以造成腸道菌群失調，影響腸道微生態平衡，益生菌可以通過調節腸上皮細胞間的連接和通透性，來調節其屏障功能，而富硒益生菌集中了硒元素和益生菌兩者的優勢。目前國內研究主要集中在飼料添加、增強動物免疫功能和調節脂代謝等方面。國際上的研究也主要和免疫功能及代謝相關[14]，在對于腸上皮細胞屏障的研究中還未見報道。益生菌的種類繁多，本研究我們選擇了長雙歧桿菌的DD98菌株進行研究。

本研究運用離體模型，研究富硒長雙歧桿菌水溶性蛋白對大鼠腸上皮細胞IEC6的保護作用。富硒長雙歧桿菌中總硒含量為(0.35±0.05)mg·g-1，其中水溶性蛋白硒含量為(0.26±0.04)mg·g-1，說明硒元素主要存在于水溶性蛋白中。本研究發現，水溶性蛋白能增強IEC6細胞活力，抑制LPS誘導的IEC6細胞凋亡及細胞線粒體膜電位倒塌，從而減少LPS對腸上皮細胞的損傷。

腸上皮細胞屏障與頂端連接復合體(apical junctional complex，AJC)有密切關系，而AJC包含了兩類多分子蛋白復合物，分別是緊密連接和黏附連接。緊密連接纖維包含了由幾種連接細胞骨架的整合膜蛋白和周邊膜蛋白所構成的復合物[15]。整合膜蛋白包括Occludin、連接黏附分子、Claudin家族蛋白和Tricellulin。整合膜蛋白細胞外的部分還能夠形成細胞間相互作用，胞質內的N-和C-末端能結合胞質中的ZO-1、ZO-2和ZO-3。ZO蛋白的作用是將緊密連接的胞質組分和肌動蛋白-肌球蛋白細胞骨架連接在一起。因此，Occludin和ZO-1的表達降低將破壞細胞間的連接，導致屏障功能受損。本研究我們也發現，LPS能夠降低Occludin和ZO-1的mRNA水平，而富硒長雙歧桿菌的水溶性蛋白能抑制LPS的這種作用，提高Occludin和ZO-1的mRNA水平。

綜上所述，富硒長雙歧桿菌的水溶性蛋白能對腸上皮細胞起到保護作用，并能恢復受損的腸上皮細胞間緊密連接，有利于改善腸道屏障功能。由于水溶性蛋白是富硒長雙歧桿菌的主要成分，因此，也預示著該富硒長雙歧桿菌DD98有助于在整體水平恢復腸道屏障，改善胃腸道功能。為了安全應用，仍然需要進一步驗證益生菌菌株的特異性和富硒長雙歧桿菌的水溶性蛋白的劑量依賴性的調節作用。本研究證實益生菌能夠促進腸上皮防御能力，為飲食預防和治療由腸道病原體引發疾病研究提供了科學依據，同時對未來深入研究益生菌維護腸道健康具有一定的指導意義。