補陽還五湯對腦缺血/再灌注大鼠神經干細胞移植后神經功能的保護作用

吳 增，董賢慧，周曉紅，靳曉飛，高維娟

(1．河北中醫學院河北省心腦血管病中醫藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050200；2. 承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

缺血性腦血管疾病是危害人類健康最常見的疾病之一，具有發病率高、致死率高、致殘率高等特點。神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是神經系統的始祖細胞，可以分化為神經元和神經膠質細胞，這一生理特性為神經再生和修復提供了理論上的依據。但內源性NSCs數量少，遠不能滿足神經功能修復的需要。研究表明，外源性NSCs移植可以促進腦缺血/再灌注損傷大鼠神經功能的恢復[1-2]，并通過抑制神經凋亡蛋白的表達來減輕神經損傷[3]。補陽還五湯是治療腦中風偏癱的名方，具有補氣、活血、通絡之效，現代用于治療缺血性腦病、中風后遺癥、冠心病等。研究表明，在腦缺血后，補陽還五湯可以促進內源性NSCs的分化[4]，降低神經元的凋亡率[5]。雖然補陽還五湯與NSCs移植對缺血性腦損傷均有確切的療效，但補陽還五湯是否能夠促進NSCs移植后腦缺血/再灌注大鼠神經功能的恢復？是否可以通過調節神經元凋亡，促進神經功能的恢復？相關方面的報導甚少。因此，本實驗將補陽還五湯與NSCs移植相結合，探討其對腦缺血/再灌注大鼠的神經保護作用。

1 材料

1.1 藥物補陽還五湯，由河北中醫學院門診部提供，組方參考《方劑學》[6]：生黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g。將藥物加蒸餾水浸泡2 h，一煎加蒸餾水500 mL，煎至150 mL；二煎加水300 mL，煎至100 mL，將兩煎混合后濃縮至100 mL(1 mL約含1.43 g生藥)。于4 ℃保存備用。

1.2 實驗動物SPF級SD孕鼠10只；SPF級SD大鼠60只，♂，體質量(290±10) g，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.3 試劑DMEM/F-12(1 ∶1)、B-27、Accutase酶，購于Gibco公司；堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，購于PeproTech公司；兔抗大鼠巢蛋白(nestin)多克隆抗體，購于北京博奧森生物技術有限公司；甲苯胺藍染液，購于北京索萊寶科技有限公司；2、3、5，氯化三苯基四氮唑(TTC)染色劑，購于Biosharp公司；抗Bax、Bcl-2抗體，購于武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.4 儀器3111型二氧化碳培養箱(Thermo)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；DM5000B型光學顯微鏡、EG11508型組織包埋機、RM2255型全自動輪轉切片機(Leica公司)；IX73型生物顯微鏡(OLYMPUS公司)；H2050R型離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；51700型全自動腦立體定位儀(美國Stoelting)。

2 方法

2.1 NSCs提取、培養、鑒定[7]采用由DMEM/F12(97%)、B27(2%)、青鏈霉素(1%)、EGF(20 μg·L-1)、bFGF(20 μg·L-1)配制成的培養基。取孕14 d的SD大鼠，麻醉后，置于75%酒精中浸泡30 min，取出子宮，置于75%酒精中浸泡2 min，在超凈臺內取出胎鼠大腦皮質，置于含有D-Hank’s液的平皿中，分離并去除腦膜，將腦組織轉移至含有培養基的平皿中，用眼科剪剪碎，收集入離心管，吹打至無可見組織塊，離心后去上清，加入培養基，吹打均勻后過細胞篩。接種后，置于培養箱中培養，每2～3 d加液1.5 mL，每6～7 d傳代1次，傳代時用Accutase酶將神經球消化成單細胞，加入培養基終止消化，離心后去上清，加入培養基繼續培養。取培養至第5代的NSCs進行nestin免疫熒光染色，鑒定細胞。

2.2 動物模型的制備采用改良線栓法建立大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，方法如下：將大鼠適應性飼養1周，術前禁食12 h、不禁水，10%水合氯醛(3.5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，固定大鼠，備皮，碘伏消毒，在頸部正中做2 cm切口，鈍性分離肌肉，解剖出左側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)。血管夾夾閉CCA和ICA，在ECA上靠近動脈分叉處與遠離動脈分叉處，各結扎1根手術縫合線，靠近分叉處縫合線打結但不系死，用顯微剪于兩根手術線之間剪一斜口，將線栓經斜口插至頸動脈分叉處，將靠近分叉處縫合線系死，在兩根縫合線之間離斷ECA，松開血管夾，調整線栓插入方向與ICA一致，用眼科鑷輕輕將線栓送入ICA，插入深度由分叉處算起(18±1)mm。缺血2 h后，拔出線栓，將ECA殘端系死，碘伏消毒，縫合傷口。術后24 h進行神經功能缺損評分，按Zea Longa 5分制評分標準：0分，無神經系統缺損癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，行走向對側轉圈；3分，行走困難，向對側傾倒；4分，不能自發行走，喪失意識；5分，動物死亡。1、2、3分為模型成功，列為實驗對象。

2.3 分組與給藥將60只SD大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、補陽還五湯組、移植組、補陽還五湯+移植組。假手術組線栓由ECA插入ICA約5 mm即可，其余各組造模方法相同。采用灌胃給藥的方式，補陽還五湯組與補陽還五湯+移植組于MCAO模型麻醉清醒后給藥，劑量為14.8 g·kg-1·d-1，每日分兩次給予，其余各組給予等體積的蒸餾水。各組大鼠于造模術后d 14進行指標檢測。

2.4 NSCs移植對培養至第5代6～7 d的NSCs進行傳代，將神經球消化成單細胞，以1 000 r·min-1離心10 min，去上清，加入無菌生理鹽水，調整細胞濃度為1.0×1011·L-1備用。移植組與補陽還五湯+移植組在大鼠MCAO模型制備成功24 h后，重新麻醉，固定于腦立體定位儀上，頭頂部皮膚備皮消毒，正中矢狀位做2 cm切口，暴露前囟，微量注射器吸入備好的NSCs懸液10 μL，將微量注射器固定于腦立體定位儀上，以前囟為坐標原點，定位并鉆孔，將NSCs懸液緩慢注射到左側紋狀體區(AP=0.36 mm，ML=3.15 mm，DV=5.5 mm)7 μL，注射到左側大腦皮質(AP=0.36 mm，ML=3.15 mm，DV=2.0 mm)3 μL，注射速度為1 μL·min-1，注射完畢后留針10 min，緩慢拔出注射器，骨蠟封閉針孔，碘伏消毒，縫合皮膚。其余各組注射等體積無菌生理鹽水。

2.5 TTC染色檢測大鼠腦梗死體積大鼠斷頭取腦，迅速取出大腦置于腦切片磨具中，-80 ℃冰箱內冷凍5 min，從前至后對大腦行冠狀位切片，共切5片，每片厚度為2 mm，置于由PBS配制的質量分數為2%的TTC染液中，37 ℃避光恒溫孵育30 min，每隔15 min翻動1次。將腦組織切片置于4%多聚甲醛中固定4 h后拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析大腦梗死體積。

2.6 腦組織固定與切片將大鼠麻醉后固定于操作臺，于胸腔正中迅速剪開皮膚、肌肉與肋骨，暴露心臟，于心尖處剪口，插入灌流針至主動脈處并固定，于右心房處剪一小口，先灌注50 mL預冷的生理鹽水，再灌注預冷的4%多聚甲醛50 mL，迅速斷頭取腦，將腦組織浸泡于4%多聚甲醛中24 h。以AP=0.36 mm為起始面，對腦組織由前至后行2 mm厚冠狀位切片，然后進行組織脫水、透明、浸蠟和包埋。用全自動輪轉切片機做厚度為3 μm的冠狀位石蠟切片。

2.7 尼氏染色觀察缺血半暗帶細胞形態并分析尼氏體累積光密度值將石蠟切片經二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，將切片放入0.5%甲苯胺藍染液中染色5 min，蒸餾水洗，1%的冰醋酸稍分化，蒸餾水洗終止反應，顯微鏡下控制分化程度，蒸餾水洗后，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察、拍照，觀察細胞形態，并用Image-Pro Plus 6.0軟件分析尼氏體累積光密度值。

2.8 免疫組織化學染色法檢測缺血半暗帶Bcl-2與Bax的表達將石蠟切片脫蠟至水，然后置于檸檬酸修復液中，于微波爐內進行抗原修復，切片放入3%雙氧水溶液中，室溫避光孵育25 min，山羊血清封閉液覆蓋組織，室溫封閉30 min，甩掉封閉液，在切片上滴加由PBS配制的一抗，切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜，滴加與一抗相應種屬的二抗，室溫孵育50 min，滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色，蘇木精復染3 min，自來水沖洗，蘇木精分化液分化數秒，自來水沖洗，蘇木精返藍液返藍，流水沖洗，梯度乙醇、二甲苯脫水透明，切片稍晾干后，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件對相同的棕黃色細胞進行計數。

3 結果

3.1 NSCs培養及鑒定結果如Fig 1所示，第5代神經球生長狀態良好。nestin免疫熒光染色呈陽性(Fig 2)。

Fig 1 Neurospheres in good state (×400)

3.2 各組大鼠神經功能缺損評分的變化如Fig 3所示，大鼠造模術后14 d，假手術組無神經功能缺損。與假手術組相比，模型組神經功能缺損評分增高(P<0.05)；與模型組相比，補陽還五湯組、移植組、補陽還五湯+移植組神經功能缺損評分降低(P<0.05)；與移植組相比，補陽還五湯+移植組神經功能缺損評分降低，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 Positive pictures of 5th neurospheres nestin immunofluorescent staining (×400)A: The nestin protein of neurospheres labeled with Cy3; B: DAPI to redye the nucleus of NSCs; C: Merged A and B.

Fig 3 Statistical analysis of nerve function defect score of rats in each group n=6)

#P<0.05vssham;*P<0.05vsmodel;▲P<0.05vstransplant

3.3 各組大鼠腦梗死體積的變化如Fig 4所示，假手術組未見梗死灶。與假手術組相比，模型組腦梗死明顯(P<0.05)；與模型組相比，補陽還五湯組、移植組、補陽還五湯+移植組腦梗死體積明顯縮小(P<0.05)；與移植組相比，補陽還五湯+移植組腦梗死體積縮小，差異具有顯著性(P<0.05)。

3.4 各組大鼠神經元形態學與尼氏體累積光密度值的變化如Fig 5所示，假手術組細胞數量較多，輪廓清晰，尼氏體豐富，細胞排列規則。與假手術相比，模型組細胞較少，輪廓模糊不清，尼氏體明顯減少，細胞排列紊亂，尼氏體累積光密度值明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，補陽還五湯組、移植組、補陽還五湯+移植組細胞狀態明顯好轉，輪廓較清晰，尼氏體增多，尼氏體累積光密度值明顯增加(P<0.05)。與移植組相比，補陽還五湯+移植組尼氏體累積光密度值增加，差異具有顯著性(P<0.05)。

3.5 各組大鼠腦組織中Bcl-2/Bax表達的變化如Fig 6所示，假手術組大鼠腦組織中僅有少量Bcl-2和Bax表達，與假手術組相比，模型組Bcl-2與Bax表達增加，Bcl-2/Bax明顯下降(P<0.05)。與模型組相比，補陽還五湯組、移植組、補陽還五湯+移植組Bcl-2表達增加，Bax表達減少，Bcl-2/Bax明顯升高(P<0.05)。與移植組相比，補陽還五湯+移植組Bcl-2表達增加，Bcl-2/Bax升高，差異具有顯著性(P<0.05)。

4 討論

對于腦血管疾病的治療，目前臨床上主要采用超早期溶栓、腦神經保護和恢復期的神經康復等措施，雖然部分患者神經功能恢復較好，但仍有一大部分患者遺留癱瘓、失語等嚴重疾患。因此，如何積極有效地促進腦缺血/再灌注損傷后恢復期神經功能的恢復，仍是目前研究的重點。近年來，隨著體外培養NSCs技術的不斷成熟，外源性NSCs移植已用于多種神經系統損傷和退行性疾病的治療。NSCs移植治療腦缺血/再灌注損傷的機制可能包括以下幾個方面：①NSCs可以分化為神經元，替代受損的神經元而發揮生理作用；②抑制神經元凋亡，減輕神經元損傷[8]；③NSCs可以產生許多生長因子，促進神經功能恢復；④激活損傷區神經元的自我修復功能；⑤促進缺血區微血管再生，改善局部微循環障礙[9]。

Fig 4 Cerebral infarct volume examined by TTC staining of rats in each group n=6)

#P<0.05vssham;*P<0.05vsmodel;▲P<0.05vstransplant

腦缺血/再灌注損傷屬中醫“中風”范疇，清代醫家王清任提出“中風”乃系機體“元氣虧損，經絡空虛，氣向一側歸并而呈半身不遂”，并創立了補陽還五湯。中風恢復期以氣虛血瘀證候最為常見，氣行則血行，氣虛則血液運行不暢，脈絡瘀阻，筋脈失養而發為偏枯，本證氣虛為本，血瘀為標。補陽還五湯具有補氣、活血、通絡的功效，益氣活血恰合病機。本方以黃芪為君藥，補氣以行血；當歸尾活血通絡而不傷血，用為臣藥；桃仁、赤芍、紅花、川芎協同當歸尾活血祛瘀；地龍通經活絡，周行全身，以行藥力，諸藥合用，則氣旺、淤消、絡通，諸癥向愈。腦缺血/再灌注損傷的發病與興奮性氨基酸毒性作用、腦組織能量衰竭、炎癥反應、細胞凋亡、免疫調節異常等機制相關[10]。現代研究認為，補陽還五湯可以在許多方面發揮神經保護作用，如抑制細胞凋亡[11]、改善微循環障礙[12]、抑制血小板活化[13]、抗氧化[14]、調節腦組織能量代謝[15]等。細胞凋亡是在體內外因素誘導下，由嚴格和復雜的信號網絡調控而發生的細胞自主性程序性的死亡過程。凋亡蛋白Bcl-2與Bax的比率反映了細胞凋亡的程度，比值越高，凋亡程度越輕，細胞存活率越高。

Fig 5 Nissl staining in brain tissue of rats in each group (×400)

Fig 6 Expression of Bcl-2 and Bax of brain tissue of
rats in each group(×400)

本實驗發現，補陽還五湯組與移植組較模型組神經功能缺損程度減輕，腦梗死體積縮小，尼氏體累積光密度值增高，Bcl-2/Bax增高，而補陽還五湯+移植組神經修復作用更為明顯。據此推測，補陽還五湯聯合NSCs移植可能通過抑制腦缺血/再灌注損傷大鼠神經元凋亡，發揮神經保護作用。有研究表明，NSCs可以在神經損傷區存活和遷移，從而上調Bcl-2的表達，來抑制損傷區神經元凋亡[16]。補陽還五湯也可以促進NSCs移植后的增殖和遷移[17]，促進體外培養的NSCs分化為神經元和神經膠質細胞。由此我們設想，補陽還五湯有可能對移植后NSCs增殖、分化及遷移起到促進作用，從而進一步抑制神經元凋亡，發揮神經保護作用。

綜上所述，補陽還五湯可以對NSCs移植后腦缺血/再灌注大鼠神經元凋亡起到抑制作用，從而發揮神經保護作用。為了更好地發揮補陽還五湯與NSCs治療缺血性腦損傷的協同作用，后續實驗中我們將探討補陽還五湯是否對移植后的NSCs增殖、分化及遷移有促進作用。