黃芪白術湯下調miR-31-5p/STAT3環路抑制結腸炎相關性結腸癌進程

鄧 頌，王愛萍，陳 曦，巫燕莉，李燕舞

(廣州中醫藥大學脾胃研究所中藥藥理室，廣東 廣州 510405)

臨床及基礎研究表明，腸道慢性炎癥的反復損傷、修復、增生，引起基因突變，從而引起細胞癌變。結腸炎相關性結腸癌(colitis-associated colorectal cancer，CAC)是結腸炎-癌病理過程的典型模型，其發病機制目前認為呈現“炎癥-不典型增生-癌變”。炎癥與腫瘤發生的機制是當前研究的熱點之一[1-2]。

STAT3可通過介導炎癥介質的細胞外信號，調控腫瘤細胞、免疫細胞等的生物學行為，是慢性炎癥促進腫瘤發生及腫瘤相關性炎癥形成過程中不可或缺的關鍵性分子。STAT3活化引起的炎癥通路的激活，導致腸黏膜屏障破壞，是結腸炎發生、發展的重要因素[3]。潰瘍性結腸炎患者中STAT3表達明顯升高，IL-6/STAT3信號通路在潰瘍性結腸炎向結腸癌轉變過程中發揮重要作用[4-6]。同時，microRNAs是炎癥和癌癥的關鍵參與者，一些microRNAs可以作為炎癥介質，另一些可以作為癌基因或腫瘤抑制因子。在此過程中，microRNAs與STAT3激活之間的關系尚不明確。黃芪白術湯由黃芪與白術組成，黃芪具有益氣健脾、補氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效，為補中益氣之良藥；白術具有補氣健脾、燥濕利水、固表止汗等作用，主要用于治療脾胃氣虛證，脾虛泄瀉，消化不良，胃腸疾病。二者配伍使用對結腸癌，脾胃虛弱，大腸陰津耗傷者具有獨特療效。因此，本課題組擬初步探討差異表達的microRNA與STAT3在CAC進程中的作用及黃芪白術湯的干預機制。

1 材料與方法

1.1 藥物黃芪(產地：內蒙古，生產批號：YPA7E0003)，白術(產地：浙江，生產批號：YPA7E004)，購自廣州采芝林連鎖藥店。以黃芪 ∶白術3 ∶1(黃芪210 g，白術70 g)混合后，在10倍的純水中浸泡0.5 h，武火煮沸后，文火煎至(100～200) mL液體，紗布過濾，藥渣再加入10倍體積純水，煎至(100～200) mL。混合2次藥液，在真空旋轉蒸發器中濃縮到(100～150) mL，之后將液體置于冷凍干燥機中，直到液體完全干燥。制備好的凍干粉貯存于-20 ℃。使用時，將凍干粉與純水混合成0.6 kg·L-1(黃芪白術低濃度，HBL)和1.2 kg·L-1(黃芪白術高濃度，HBH)用于小鼠灌胃給藥。黃芪甲苷(UV≥98%，貨號912A023)，購自北京索萊寶生物科技有限公司；白術內酯(UV≥98%，貨號PA0808RA13)，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗動物與細胞株C57BL/6小鼠，SPF級，4～6周齡，體質量20 g左右，♀♂各半，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物質量合格證：SYXK(粵)2013-0001。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，購自吉妮歐公司。

1.3 試劑氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)，購自Sigma-Aldirich公司；葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)，購自MP；LipofectamineTM2000、miR-31-5p precursor，均購自Life Technologies；GAPDH抗體，購自Abcam；STAT3抗體，購自Cell Signaling；IL-6Rα、p-STAT3抗體，購自Santa Cruz；miRNA提取試劑盒，購自康為世紀；miRNA逆轉錄試劑盒，購自TaKaRa公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 儀器Mini-protean Tetra System電泳儀、Trans-Blot? SD Cell轉印系統、ChemiDocTMXRS+成像儀、熒光定量PCR儀、Imark酶標儀(Bio-Rad公司)；超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo Scientific公司)；FD系列冷凍干燥機(上海天豐)；Axon GenePix4000B芯片掃描儀(Axon公司)。

1.5 方法

1.5.1CAC小鼠模型的構建及樣品采集 C57BL/6小鼠喂養于廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF動物室。小鼠適應性喂養3 d后，除正常組外，一次性腹腔注射AOM(12 mg·kg-1)，然后正常喂養2 d。在d 3，給予3% DSS水自由飲用5 d，之后正常喂養16 d，此為DSS刺激第1個循環，重復DSS刺激3個循環。4周后，按HBL和HBH不同劑量開始灌胃給藥，模型組和對照組給予純水。所有動物實驗過程均經廣州中醫藥大學動物倫理學委員會批準。8周后常規處死動物，采用Swiss-roll方式、4%多聚甲醛固定結腸組織，用于病理觀察。部分結腸組織液氮保存，用于microRNA測序，其他結腸組織-80 ℃保存備用。

1.5.2RAW264.7細胞株轉染 RAW264.7對照組加LipofectamineTM2000 10 μL到3 mL體系，miR-31-5p高表達組以LipofectamineTM2000 10 μL+3 μL 50 μmol·L-1miR-31-5p precursor加入3 mL體系，48 h后收集細胞。

1.5.3ClariomTMD微陣列檢測對照組和CAC小鼠中miRNA的差異表達 TRIzol法提取RNA后，用RNasey Mini Kit純化。RNA標記與芯片雜交根據Exiqon提供的方法進行。使用芯片掃描儀掃描芯片。

1.5.4qPCR檢測 體外采用IL-6(50 mg·L-1)刺激RAW264.7 24 h后，加入白術內酯Ⅱ+黃芪甲苷復合物繼續刺激24 h，收集細胞。小鼠結腸組織和RAW264.7細胞收集后，按照miRNA提取試劑盒說明書的步驟提取miRNA，進行逆轉錄。qPCR條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環，U6為內參。miR-31-5p引物序列：F:5′-CGGGCAGGCAAGATGCTGGC-3′，R:5′-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3′；U6引物序列：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.5.5Western blot檢測相關蛋白 全蛋白提取試劑盒提取結腸組織和細胞中的蛋白后，BCA蛋白含量檢測試劑盒測蛋白濃度。用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白樣品，轉移到PVDF膜上，一抗4 ℃孵育過夜。二抗在室溫下孵育1.5 h，ECL顯影后，掃描，Image Lab進行條帶分析，目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 CAC模型小鼠microRNA的差異表達CAC小鼠造模過程中出現精神萎靡不振、食量減少、身體消瘦、體質量減輕、便血、腹瀉等癥狀。CAC模型8周小鼠結腸組織形態學觀察顯示(Fig 1)，黏膜腺體排列紊亂，杯狀細胞明顯減少，黏膜及黏膜下層出現不同程度的炎細胞浸潤，結腸遠端黏膜出現中重度異型增生。microRNA測序結果顯示，miR-31-5p、miR-132、miR-223等明顯增高，經real-time PCR檢測表明，miR-31-5p升高尤為明顯(Fig 2)。提示miR-31-5p可能是結腸炎-癌發展過程中的病理診斷標志物，并調控可能的靶基因，參與結腸黏膜異型發生。

A: Control group; B: control group; C: 8w CAC; D: 8w CAC

2.2 CAC模型小鼠結腸黏膜STAT3蛋白表達與對照組相比，CAC模型組小鼠結腸STAT3、p-STAT3蛋白表達明顯升高；HBL及HBH干預后，均可降低STAT3、p-STAT3蛋白表達(Fig 3)。

2.3 miR-31-5p與STAT3形成正相關循環通路RAW264.7細胞轉染miR-31-5p precursor使其高表達后，STAT3蛋白明顯增高(Fig 4A)。采用炎癥因子IL-6(50 μg·L-1)或TNF-α(50 μg·L-1)刺激RAW264.7細胞24 h后，miR-31-5p水平明顯增高(Fig 4B)。以上結果提示，miR-31-5p與STAT3激活形成一個正相關的循環，可能參與結腸黏膜炎-癌病理進程。

2.4 黃芪白術湯及單體復合物對miR-31-5p/STAT3的干預作用與CAC模型組相比，HBL與HBH組miR-31-5p表達下降(Fig 5A)，同時降低STAT3、p-STAT3蛋白表達(Fig 3); 白術內酯Ⅱ和黃芪甲苷(atractylenolide Ⅱ and astragaloside，ATRII+AST)復合物不同濃度(25、50 mg·L-1)干預，可降低IL-6引起的miR-31-5p的表達水平增高(Fig 5B)，同時，降低STAT3、IL-6Rα的表達(Fig 5C)。

Fig 2 Differential expression of microRNA in CAC model mice

3 討論

研究表明，局部炎癥微環境促進腫瘤的形成機制包括：激活癌前細胞增殖和抗凋亡特性，同時導致細胞積累突變和遺傳變異[7]。慢性腸道炎癥通過促炎性細胞因子的產生、細胞增殖、免疫應答的改變，促進CAC的腫瘤發生[8-9]。CAC小鼠模型早期，IL-6大多是由髓樣細胞產生的，其他細胞，如T細胞、腸上皮細胞也能產生IL-6。而骨髓來源的IL-6與潛在的慢性炎癥密切相關，上皮細胞和腫瘤細胞產生的IL-6能促進新的腫瘤產生。與正常人活檢對比，潰瘍性結腸炎病人結腸上皮細胞中IL-6/STAT3被明顯激活，而且STAT3顯色陽性結果與炎癥的嚴重程度相關[10]。

Fig 3 Expression of STAT3 and p-STAT3protein in mouse colonic

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsCAC

microRNA的異常表達和結腸癌之間密切相關，microRNA具有作為結腸直腸癌生物標志物和治療靶點的潛力，目前認為可以作為早期檢測的生物標記和預后的分類器[11]。microRNA參與結腸炎-癌病理發生機制尚不明晰。采用腫瘤細胞與免疫細胞共培養研究發現，IL-6與miR-21、miR-29b可以形成環路，進行免疫細胞與腫瘤細胞之間的“交流”，從而維持慢性炎癥，并促進腫瘤細胞的侵襲特性。腫瘤微環境中的細胞交流可能為未來治療措施提供思路[12]。本研究發現，miR-31-5p可能是結腸炎癥和腫瘤發生的關鍵參與者，在小鼠CAC模型中miR-31-5p明顯增高，且與IL6/STAT3信號通路的激活存在正向調控作用，miR-31-5p可能參與了腸道上皮細胞及免疫細胞之間的cross-talk，并且放大炎癥信號，進而引起上皮細胞異型增生，乃至腫瘤的發生，其作用機制有待繼續深入探討。

目前，結直腸癌的治療主要以外科治療為主。采用放療、化療和靶向治療，5年生存率仍徘徊在50%左右[13]。另外，定期電子腸鏡檢查是早期診斷CAC的重要手段(屬于二級預防),許多學者試圖探索在治療潰瘍性結腸炎的同時，能夠找到對CAC有預防作用的藥物，期望這些藥物能夠逆轉、抑制、預防CAC的發生與發展。中醫藥在緩解結腸炎癥、修復腸道黏膜損傷等方面具有獨特的療效，且前期研

Fig 4 miR-31-5p with STAT3 formed a

A:STAT3 protein expression significantly increased after RAW264.7 transfection with miR-31-5p precursor; B: After IL-6(50 μg·L-1), TNF-α(50 μg·L-1) stimulated RAW264.7 cells for 24 h, the expression level of miR-31-5p was significantly up-regulated.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

究表明，益氣健脾方藥可通過調節IL-6/STAT3，干預潰瘍性結腸炎的急慢性病理過程。中醫理論認為，脾虛氣滯是結腸炎相關性結腸癌的基礎，補氣健脾是其基本治療方法[14]。黃芪白術湯源于金元醫家劉完素《素問病機氣宜保命集·瀉痢論》，也是勞紹賢教授治療脾虛氣滯所致結腸炎和CAC的基礎復方。前期研究表明，黃芪白術湯及其有效部位具有明顯的抗炎作用，對潰瘍性結腸炎和CAC的病理變化有抑制作用[15]。體外研究發現，黃芪甲苷及白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對消化道腫瘤有較好的治療作用[16-17]。本研究結果表明，黃芪白術湯及其單體復

Fig 5 Intervention of Huangqi Baizhu decoction and monomer complex on miR-31-5p/STAT3

合物可通過抑制miR-31/STAT3的激活，阻滯CAC病理進程。本研究提示，miR-31-5p可作為CAC或相關結腸腫瘤的早期生物標記，并為臨床以microRNA為治療靶標提供了思路。