石上柏中雙黃酮對DPPH自由基的清除作用研究

朱田密 ，陳樹和，張金亮，陳科力

(1.湖北省中醫院 藥事部，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫藥研究院 中藥研究所，湖北 武漢 430074；3.武漢華夏理工學院 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430223；4.湖北中醫藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065)

石上柏是卷柏科卷柏屬植物深綠卷柏Selaginella doederleinii Hieron.的全草，為臨床常用中藥，具有清熱，除濕，解毒的功效；主治咽喉腫痛，目赤腫痛，肺熱咳嗽，濕熱黃疸，風濕痹痛[1]。臨床中還治療婦科等疾患。石上柏化學成分含有生物堿類和黃酮類等，其中所含有的雙黃酮類是卷柏科以及某些裸子植物的特征化學成分[2]。這類成分具有抗氧化，抗腫瘤，抗病毒，降血糖等活性[3-6]。Wang G等從深綠卷柏的乙酸乙酯部位檢測到9種具有抗氧化效果的雙黃酮[7]。而純化后的總雙黃酮的抗氧化活性尚未見報道。筆者對石上柏中的總雙黃酮進行提取純化，并分析組成，測試抗氧化活性。DPPH是一種穩定的氮中心的自由基，廣泛用于評價各種合成的或天然的抗氧化劑對自由基的直接清除作用[8]。本研究利用DPPH自由基清除法評價石上柏中雙黃酮類的抗氧化活性。

1 儀器與試藥

ES225SM-DR電子天平(瑞士普利賽斯公司)，4000 Q TRAP液質聯用儀(美國AB Sciex公司)，SPECORD plus210紫外可見分光光度計(德國耶拿分析儀器股份公司)，XW-80A微型旋渦混合儀(金壇市盛藍儀器制造有限公司)。

石上柏中藥飲片(湖北辰美中藥有限公司，產地湖北)，經筆者鑒定為石上柏即深綠卷柏Selaginella doederleinii Hieron.的干燥全草，樣品留存于湖北省中醫院中藥研究所標本室；抗壞血酸(L-Ascorbic acid，美國Sigma公司)；DPPH自由基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，美國Sigma公司)；聚酰胺粉(武漢藥科新技術開發有限公司)；Sephadex LH-20(北京慧德易科技有限責任公司)；無水乙醇，三氯甲烷，甲醇等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 雙黃酮的提取與成分分析

取40g石上柏中藥飲片用90%乙醇500mL回流提取5次，過濾，濃縮，干燥，得干膏。干膏經聚酰胺柱色譜(30～60目)，40%～80%乙醇洗脫，濃縮得雙黃酮粗品；再經過Sephadex LH-20凝膠色譜，三氯甲烷-甲醇洗脫，洗脫液濃縮后得黃色粉末狀雙黃酮結晶120mg。采用HPLC-MS對樣品進行分析，結合參考文獻[7]，檢測到該雙黃酮混合物由穗花杉雙黃酮(539.2[M+H]+)，羅波斯塔雙黃酮(539.2[M+H]+)，7-去甲基銀杏雙黃酮(553.2[M+H]+)，羅波斯塔-4' -甲醚(553.2[M+H]+)，羅漢松雙黃酮A(553.2[M+H]+)組成。

2.2 雙黃酮的抗氧化活性測試

取石上柏雙黃酮混合結晶5.23mg溶解于25mL無水乙醇，稀釋得6種不同濃度的樣品溶液(0.0026～0.2092mg/mL)。另配制濃度為0.05mg/mL的DPPH·無水乙醇溶液，以及6種不同濃度的抗壞血酸對照組溶液(0.0029～0.2312 mg/mL)。分別取1.0mL樣品溶液或對照溶液與2.0mLDPPH·溶液加入4mL塑料離心管中，渦旋混勻，避光反應20分鐘，用紫外波長516nm測量吸光度，每個樣品測三次取平均值。DPPH·清除率用下式計算[7]。I(%)=[(Ab-As)/Ab]×100%，Ab是空白樣品吸光度，As是反應液吸光度。實驗得到石上柏中雙黃酮與對照組抗壞血酸對DPPH·清除率的結果見圖1。由圖可知，石上柏中雙黃酮對DPPH·的清除率隨其濃度的增加而增大，實驗濃度范圍內，石上柏中雙黃酮對DPPH·的最大清除率為8.0%，而抗壞血酸為95.5%。

圖1 化合物對DPPH自由基的清除曲線

3 討論