基于亞鐵離子催化分光光度法測定葡萄糖

馬業菲，付小芬，于麗平，何 文，高 燕，褚然然

(齊魯理工學院,山東 濟南 250200)

葡萄糖是人體內不可缺少的一種物質，直接影響人體內的新陳代謝。近年來，糖尿病的發病率在全球一直呈現上升狀態。糖尿病已經成為威脅人類健康的一種疾病。

因此，對于糖尿病患者來說早診斷、早治療是十分重要的，實時快速監測糖尿病人血液中葡萄糖的含量對控制病情具有非常重要的意義。近年來，文獻報道了很多檢測葡萄糖的新方法，如熒光法[1]，電化學法[2]，色譜法[3]，等。熒光法具有靈敏度高、檢出線低等優點，但成本高、應用范圍小；電化學法具有靈敏度高、準確度高等優點，但選擇性差；色譜法具有分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高等優點，但分析成本高。所以發展一種較為簡便的葡萄糖檢測新方法具有十分重要的意義。

分光光度法由于簡單、快速、無需昂貴的分析儀器、可進行可視化檢測等優勢而備受青睞。但多數依賴于金納米粒子[4]、氧化鈰納米粒子[5]，納米粒子合成過程比較復雜，且一般需要進行水溶性處理，操作復雜。因此，建立了一種簡便、快速的分光光度法法對葡萄糖的檢測是非常有必要的。該研究以Fe(II)來催化H2O2氧化底物TMB發生顯色反應。有效的避免了其他納米粒子的缺陷，具有成本低、操作方便、快速等優點。本研究基于Fe(II)增強了H2O2-TMB反應，建立了一種新的分光光度法并用于葡萄糖的檢測。

1 試劑和試劑

1.1 試劑

3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，氯化亞鐵，葡萄糖，葡萄糖氧化酶，果糖，乳糖，麥芽糖，糖尿病病人的尿液(液)，過氧化氫，三羥甲基氨基甲烷，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，鹽酸。

1.2 儀器

UV-752N型紫外可見分光光度計、UV-1750型紫外可見分光光度計、恒溫水浴鍋。

2 實驗方法

(1)將不同濃度的葡萄糖溶液加入2.0mL離心管中，加入適量的磷酸緩沖溶液(pH值=7.0)，再加入GOD 25μL(終濃度為10-3g/mL)。將水浴鍋逐漸升溫到37℃后把混合液放入水浴鍋中反應30 min。

(2)加入30μL TMB(終濃度為2.0×10-3mol/L)、1240μL Tris-HCl緩沖溶液(pH值=5.5)和30μL Fe(II)溶液(終濃度為2.0×10-4mol/L)于上述反應液中在2.0mL離心管中混合反應，溶液的終體積為1.5mL。反應5min后測定體系中葡萄糖的含量。

(3)特異性測定實驗中果糖、乳糖、麥芽糖(終濃度均為8.0×10-3mol/L)代替葡萄糖。

(4)實際樣品中糖尿病患者的尿液50μL代替葡萄糖。

3 結果與討論

3.1 實驗原理

圖1 葡萄糖檢測反應原理圖

如圖1所示，在催化劑Fe(II)的作用下，H2O2產生羥基自由基，進而快速的將TMB氧化成oxTMB并且發生明顯的顏色變化，且GOD分解葡萄糖產生H2O2。體系在650 nm處的吸光度與葡萄糖的濃度在一定的范圍內呈正比。因此，我們可以根據吸光度的變化對葡萄糖進行分析與檢測。

3.2 可行性驗證

為了驗證本實驗方法的可行性，我們對Fe(II)催化H2O2氧化TMB的催化活性進行探究。如圖2A所示，將不同濃度的Fe(II)加入到含有TMB和H2O2的溶液中，觀察到隨著Fe(II)濃度的增加，顏色越來越深，并且650nm處的吸光度也不斷升高。

該體系利用GOD氧化葡萄糖而產生的H2O2進行實驗，為了保證實驗的可行性，需要進一步驗證。如圖2B所示，在不含葡萄糖的條件下，無H2O2的生成，測定的吸光度很小。在含有GOD和Fe(II)的條件下，加入不同濃度的葡萄糖溶液，可以觀察到隨著葡萄糖含量的增加，吸光度越來越大。結果表明，該方法可以用于葡萄糖的檢測。

圖2 不同條件下樣品溶液的吸收光譜圖

3.3 實驗條件的優化

為了提高實驗的準確性及靈敏度，本實驗對影響葡萄糖測定的主要因素：pH值、溫度、濃度、時間等實驗條件進行了優化。

在固定Fe(II)、H2O2和TMB的濃度下，考察了不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液對信噪比的影響。結果表明pH值=5.5的Tris-HCl緩沖溶液信噪比最大。

在固定H2O2和TMB的濃度下，我們設置一系列不同濃度梯度的Fe(II)溶液去催化TMB發生顯色反應。通過實驗結果，將2.0×10-4mol/L定為Fe(II)溶液的最佳濃度。

在固定Fe(II)和TMB的濃度下，探究不同濃度的H2O2對吸光度的影響。結果表明，當濃度達到5.0×10-4mol/L時，吸收峰的峰值基本不再發生變化，因此我們把5.0×10-4mol/L作為H2O2的最佳濃度。

在固定Fe(II)、H2O2和TMB的濃度下對時間和溫度進行了探究。通過實驗結果，我們選取最優分解時間為30min，最適的反應溫度為37℃。

3.4 葡萄糖標準曲線的繪制

圖3 葡萄糖在650nm處標準曲線

在最優實驗條件下建立了基于Fe(II)催化的葡萄糖檢測新方法，實現了對于葡萄糖含量的定量檢測。650nm處的吸光度值與葡萄糖濃度在2.0×10-3～1.0×10-2mol/L范圍內存在良好的線性關系(圖3)，線性方程為：I = 0.1064C + 0.2248(其中I代表溶液的吸光度值，C代表葡萄糖的濃度(單位為10-3 mol/L))，相關系數為R2= 0.9983。

3.5 特異性分析

在本實驗中，我們為了驗證葡萄糖比色檢測方法的可靠性，選擇了葡萄糖類似物果糖、乳糖、麥芽糖來作為干擾對象進行分析檢測。結果表明葡萄糖有明顯的信號反應，在650nm處吸光度比較大，而其他糖類基本沒有信號反應，吸光度值很小。因此，說明了其他糖類對葡萄糖的選擇性測定沒有影響。

3.6 實際樣品的測定

為了驗證基于Fe(II)葡萄糖檢測新方法的實用性，本實驗選取尿液作為實際樣品，用于檢測尿液中葡萄糖的含量。正常人的尿液650nm吸光度值很小，隨著加入糖尿病患者尿液體積的增加，吸光度越來越大。該檢測結果表明此方法適用于檢測糖尿病病人中尿液的葡萄糖含量，對于其它實際樣品也有一定的實用性，是一種能有效檢測葡萄糖含量的新方法。

4 結論

本研究利用Fe(II)催化TMB-H2O2體系建立了一種簡潔、快速的分光光度法并用于葡萄糖的檢測。該方法具有一些優點：不需要任何化學修飾和合成，成本較低。整個檢測過程都在均相溶液中進行，非常方便。將此方法用于實際樣品尿液的測定，由檢測結果可知，該方法可行性高，結果可靠。因此，本文所構建的分光光度法為檢測葡萄糖含量提供了一種新途徑。