蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及改進(jìn)措施

杜照奎,徐慧君,柯世省

(臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 臺(tái)州 318000)

聚丙烯酰胺凝膠電泳(ployacrylamide gel electrophoresis,PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳技術(shù)，常用作蛋白質(zhì)分離鑒定[1]。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體(Arc)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑過(guò)硫酸銨(APS)和加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的作用下聚合而成。十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)是一種陰離子蛋白質(zhì)變性劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，并且覆蓋在其表面，各亞基在從電場(chǎng)負(fù)極向正極端泳動(dòng)時(shí)，其遷移率主要取決于分子量的大小[2]。

SDS-PAGE可根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小，配制不同濃度的凝膠，從而調(diào)控凝膠的孔徑大小，可使不同分子量的蛋白質(zhì)得以分離。SDS-PAGE具有設(shè)備相對(duì)便宜、樣品用量少、操作相對(duì)簡(jiǎn)便和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)；而且該技術(shù)分辨率高，在很多情況下，優(yōu)于常用的層析、超速離心及瓊脂糖凝膠電泳[3]；此外，該技術(shù)不僅能分離蛋白質(zhì)，還能分離核酸[4]等。總之，SDS-PAGE技術(shù)廣泛地應(yīng)用于生物大分子的分離、鑒定、檢測(cè)、定性和定量分析等領(lǐng)域，在生化技術(shù)中占有十分重要的地位，因此許多高校生物類相關(guān)專業(yè)均開(kāi)設(shè)SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)。

然而，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展過(guò)程也存在一些問(wèn)題。如初學(xué)者制膠容易出現(xiàn)滲漏現(xiàn)象，凝膠時(shí)間長(zhǎng)短不易把握；染色液氣味刺激和脫色時(shí)間長(zhǎng)等。為提高學(xué)習(xí)效率，使學(xué)生盡量在課內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)并觀察到結(jié)果，同時(shí)減少試劑對(duì)學(xué)生呼吸系統(tǒng)的刺激，筆者針對(duì)以上常見(jiàn)問(wèn)題進(jìn)行了改進(jìn)，取得了較好的效果。

1 存在的問(wèn)題

1.1 凝膠制備過(guò)程中易滲漏

筆者實(shí)驗(yàn)室使用的SDS-PAGE電泳設(shè)備為北京六一生物科技有限公司DYCZ-24DN電泳儀，制膠時(shí)將厚薄兩塊玻璃板(其中厚板左右兩側(cè)有突起約2 mm的磨砂邊)對(duì)齊放入專用制膠模型中，但由于玻璃板左右兩側(cè)的凸起磨砂邊密封性較差，也沒(méi)有彈性墊托底，為彌補(bǔ)這些不足，廠家設(shè)計(jì)了一條U形橡膠條將底部和磨砂邊的外側(cè)全部兜住，形成一個(gè)左、右和底部均不漏液的密閉空間，未凝固膠液從頂部加入。該設(shè)備相對(duì)便宜，但凝膠模型的組裝難度更大，新手一般很難把握。

1.2 凝膠時(shí)間判斷不準(zhǔn)

一般而言，2h對(duì)分離膠和濃縮膠凝固都是足夠的。然而，為了縮短凝膠時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，分離膠倒入雙層玻璃板夾縫后，通常會(huì)在膠面頂端加一層去離子水以隔絕空氣。而我們?cè)谂袛嗄z體是否凝固時(shí)，常用的方法就是緩慢抬起制膠模型的一側(cè)進(jìn)行觀察。這種操作雖然直截了當(dāng)，但由于去離子水的存在，抬起的角度通常也會(huì)比較大，易對(duì)尚未凝固的凝膠產(chǎn)生擾動(dòng)，可能會(huì)進(jìn)一步增加凝膠時(shí)間，甚至造成凝膠困難；另外，擾動(dòng)也可能導(dǎo)致局部凝膠濃度不均勻，影響電泳分離效果。

1.3 染色液氣味刺激，脫色時(shí)間長(zhǎng)

目前較多實(shí)驗(yàn)室采用考馬斯亮藍(lán)R250作為SDS-PAGE的染色試劑，操作簡(jiǎn)便，染色效果好，且方便后續(xù)蛋白質(zhì)鑒定等工作。但該方法也有明顯不足：(1)需要用到甲醇作為溶劑。甲醇是一種無(wú)色、透明、易燃、易揮發(fā)的有毒液體，經(jīng)人體代謝能夠產(chǎn)生甲酸。甲酸會(huì)累積在眼睛部位，破壞視覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞，產(chǎn)生永久性損害；同時(shí)，甲酸也可進(jìn)入血液系統(tǒng)，損害人體腎臟[5]。因而，甲醇可能會(huì)對(duì)師生的身體健康帶來(lái)危害，同時(shí)實(shí)驗(yàn)廢棄試劑的排放也會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染；(2)染色和脫色時(shí)間較長(zhǎng)。一般考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色時(shí)長(zhǎng)為1-4 h，染色完畢后，清水沖洗凝膠后加入脫色液，數(shù)小時(shí)換一次脫色液，直至藍(lán)色背景褪盡，蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止，約需8～12 h[6]。本科學(xué)生的實(shí)驗(yàn)課時(shí)間一般為4 h，復(fù)雜的操作需要學(xué)生多次往返實(shí)驗(yàn)室回收染色液和更換脫色液，而且在第二天才能觀察到結(jié)果，嚴(yán)重增加了學(xué)生的負(fù)擔(dān)。

2 改進(jìn)措施及效果

2.1 巧用白吸頭解決漏膠問(wèn)題

U形橡膠條的厚度略大于厚玻璃板兩側(cè)的凸起磨砂邊條，在緊固兩張玻璃板時(shí)，由于U形條的彈力作用，可以保證板間接觸緊密，未凝固的膠液不易漏出。容易出現(xiàn)漏液的部位一般在U形條90度拐角處，如果與玻璃板貼合不夠嚴(yán)密，通常會(huì)引起漏液。曾經(jīng)有學(xué)生用力拉扯U形條兩側(cè)豎著的邊條，試圖使90度拐角處與玻璃板貼合緊密，反而更容易漏液，因?yàn)閴|子被拉長(zhǎng)的同時(shí)也變薄了，玻璃板兩側(cè)接觸反而不夠緊密。筆者實(shí)驗(yàn)室的操作是讓U形條保持自然伸展?fàn)顟B(tài)放置于兩塊玻璃板間，手持10 μL的吸頭(白色)使其尖端與U形條接觸，約成30度角，稍用力從90度拐角處沿豎直和水平方向按壓，使U形條與磨砂凸起條緊密接觸，再小心固定，通常可以妥善解決漏液?jiǎn)栴}。通過(guò)改進(jìn)，17級(jí)生物科學(xué)(師范)班92%以上的學(xué)生能夠在第一次操作保證不漏膠，相比16級(jí)學(xué)生的54%而言，效果極其顯著。

2.2 設(shè)立對(duì)照判斷凝膠是否凝固

制膠步驟在本實(shí)驗(yàn)中時(shí)間較長(zhǎng)，因?yàn)镾DS-PAGE使用的是兩層膠，即下層的分離膠完全凝固后才能制備上層的濃縮膠，如果過(guò)于心急，往往會(huì)破壞凝膠過(guò)程，要么重新制膠，耗時(shí)更多；要么電泳條帶分離效果不佳。筆者實(shí)驗(yàn)室的做法一般是用膠頭滴管吸取少量膠液，傾斜放置于制膠燒杯中作對(duì)照，25分鐘后開(kāi)始觀察是否凝固。如果滴管中的膠凝固了，通常玻璃板間的膠也凝固了；如果滴管中的膠不會(huì)凝固，提示著加樣可能出現(xiàn)問(wèn)題，多數(shù)情況下是某種試劑漏加了。設(shè)立對(duì)照后，學(xué)生可以在不擾動(dòng)板內(nèi)凝膠的情況下觀察實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，最終電泳條帶非常平直，效果良好。

2.3 用考馬斯亮藍(lán)G250 代替R250，用乙醇代替甲醇

A改進(jìn)后的考馬斯亮藍(lán)G-250脫色效果； B傳統(tǒng)的R-250脫色效果的PAGE凝膠；1、2、3泳道上樣量分別為5 μg,10 μg,10 μg。

圖1 脫色效果的比較

3 討論

SDS-PAGE電泳是一項(xiàng)極其重要的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，因?yàn)樗菣z測(cè)蛋白質(zhì)純度和評(píng)估蛋白質(zhì)分子量的常用方法。也眾所周知，尚未凝固的丙烯酰胺具有一定的神經(jīng)毒性，TEMED的味道也非常刺鼻，因而在做到這個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員都想一次成功，重復(fù)次數(shù)越少越好。

但對(duì)新手來(lái)說(shuō)，SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)中制膠步驟中漏膠現(xiàn)象較為普遍，因?yàn)樗麄兺荒苁筓形橡膠條與玻璃板緊密貼合。前一兩次漏膠會(huì)讓人心情煩悶，次數(shù)多了則會(huì)使人產(chǎn)生嚴(yán)重的畏難情緒。經(jīng)濟(jì)條件優(yōu)越的實(shí)驗(yàn)室可以選擇Bio-Rad等品牌的設(shè)備，由于其設(shè)計(jì)更為合理，通常情況下不會(huì)漏膠。但對(duì)于大多數(shù)條件一般的實(shí)驗(yàn)室，國(guó)產(chǎn)設(shè)備自然成為首選。筆者實(shí)驗(yàn)室使用一支白槍頭即可解決漏膠的問(wèn)題，為后續(xù)步驟贏得了時(shí)間，同時(shí)也為學(xué)生樹(shù)立了成功的信心。

SDS-PAGE凝膠的凝固時(shí)間受多方面因素影響，如氣溫、凝膠的濃度、制膠試劑的純度和玻璃板間夾縫的厚薄等。一般來(lái)說(shuō)，氣溫低、凝膠濃度高、試劑純度高和玻璃板間夾縫薄時(shí)，凝膠速度更快。SDS-PAGE的凝膠分為下層的分離膠和上層的濃縮膠兩層，分離膠凝固后再制備濃縮膠，因而制膠步驟時(shí)間較長(zhǎng)。學(xué)生往往會(huì)因?yàn)橄爰庇谕瓿蓪?shí)驗(yàn)，分離膠可能尚未完全凝固就制備濃縮膠，欲速則不達(dá)，這樣可能導(dǎo)致的后果要么重新制膠；要么使膠局部濃度不一，分離效果不好，最終可能還得重復(fù)。設(shè)立對(duì)照后，學(xué)生可以在不擾動(dòng)板內(nèi)凝膠的情況下觀察凝膠凝固情況進(jìn)展，電泳效果通常較好。

傳統(tǒng)的染色與脫色，一般先用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(冰醋酸-甲醇體系)對(duì)電泳后的SDS-PAGE凝膠染色，再用常規(guī)脫色液(冰醋酸-甲醇體系)脫色，不僅時(shí)間長(zhǎng)，甲醇還有一定毒性。有研究表明，微波爐應(yīng)用于SDS-PAGE凝膠的染色和脫色可以節(jié)約一些時(shí)間[8-9]。然而，這畢竟要借助于其它設(shè)備；另外，微波爐火力和時(shí)間的設(shè)定也需要一定經(jīng)驗(yàn)，控制不好可能會(huì)使凝膠融化，蛋白條帶消失。本法改進(jìn)后的步驟簡(jiǎn)單，整個(gè)染色和脫色步驟在8分鐘內(nèi)全部完成，且無(wú)需借助于微波爐或脫色搖床，易于掌握和推廣。