一株新城疫病毒Ｆ基因的克隆及其遺傳進化分析

徐萍　徐小博?。裕粒裕桑粒危? Ｆｏｔｉｎａ　王三虎　趙坤

摘要：從新鄉市某養雞場的疑似新城疫病雞群中分離到1株新城疫病毒，并對該病毒分離株進行F基因的擴增、序列測定和遺傳進化分析。結果表明，該新城疫病毒分離株的F基因全長為1 662 bp，F蛋白裂解位點區的氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，具備強毒株的特征;同源性分析表明，該新城疫病毒分離株與國內外流行的基因Ⅶ型強毒株之間的同源性較高，為87.5%～97.7%，其中與國內流行的基因Ⅶd型的參考毒株同源性最高，為95.4%～97.7%，而與現用疫苗株La Sota、Clone-30、B1、Mukteswar等同源性較低，84.2%～86.6%;系統進化樹分析表明，該新城疫病毒分離株與基因Ⅶd型參考毒株FJ882014、FJ608335和GU227738處在同一個進化分支上，親緣關系最近。

關鍵詞：新城疫病毒;F基因;克隆;序列分析;遺傳進化;雞

中圖分類號：Q78? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）15-0132-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.15.031? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning and genetic evolution analysis of one strain of newcastle disease virus

XU Ping1，2，XU Xiao-bo1，TATIANA Fotina2，WANG San-hu3，ZHAO Kun3

（1.College of Life Science and Technology，Xinxiang University，Xinxiang 453003，Henan，China;2.Department of Veterinary Medicine，Sumy National Agrarian University，Sumy 40021，Ukraine;3.College of Animal Science and Technology， Henan Institute Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

Abstract： A Newcastle disease virus（NDV） was isolated from ND suspected chickens of a scale chicken farm in Xinxiang. The F gene of the isolated Newcastle disease virus（NDV） was amplified and analyzed by genetic evolution. The results showed that the whole nucleotied sequence length of F gene was 1 662 bp. The sequence of amino acid of F gene at the cleavage site is 112R-R-Q-K-R-F117， which is consistent with the characteristics of strong NDV strain. Comparison of the NDV with the strong NDV of gene Ⅶ of epidemic strains from different countries， results showed that the nucleotide homology was 87.5%～97.7%， and in which the comparison with the Ⅶd was 95.4%～97.7%. Comparison of the NDV isolated with the current vaccine strains such as La Sota， Clone-30， B1， Mukteswar and so on， the nucleotide homology was 84.2%～86.6%. The phylogenetic tree analysis demonstrated that the NDV isolated and Ⅶd strains of FJ882014，FJ608335 and GU227738 were located in the same cladogram branch.

Key words： Newcastle disease virus;F gene;cloning;sequence analysis;genetic evolution;chicken

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是引起禽類新城疫（Newcastle Disease，ND）高度接觸性、急性、敗血性傳染病的病原[1]。該病原屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，為有囊膜的單股負鏈RNA病毒[2]。NDV基因組全長約15 kb，編碼6種結構蛋白，分別為NP、P、M、F、HN和L蛋白，其中融合蛋白（F）和血凝素-神經氨酸酶蛋白（HN）為NDV的功能性糖蛋白[3]。兩種蛋白在機體免疫應答和致病過程中起著極其重要的作用。HN蛋白在病毒侵染過程中起識別受體的作用，而F蛋白則參與病毒與宿主細胞及宿主細胞間融合過程，兩種蛋白均為NDV的保護性抗原。F蛋白裂解位點處的氨基酸序列對病毒毒力有著非常重要的影響，被看作判定NDV毒力的重要標準[4-6]。此外，根據F基因的高變區序列將NDV劃分為不同的基因型。對NDV分離株F蛋白的研究，有助于了解雞新城疫的發病原因。本研究從新鄉市某雞場分離得到的新城疫病毒對其F基因進行克隆和分析，從分子水平闡明該毒株與其他各毒株間的差異，為該病的防控及分子流行病學研究奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料及試劑

NDV病毒，分離自新鄉市某雞場;無特定病原的雞胚（SPF）購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司;大腸桿菌E.coli DH5ɑ感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司;pMD18-T vector克隆載體、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、miRCURY RNA Isolation Kit、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、普通瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒和質粒提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;Amp、Kan+、X-gal、IPTG、瓊脂粉購自Sigma公司;瓊脂糖、酵母粉和蛋白胨購自OXOID公司。

1.2? 病毒的繁殖

病毒經過分離純化后，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，37 ℃孵育72 h。無菌收集24 h后死亡雞胚尿囊液，并測定其血凝性。

1.3? 引物的設計與合成

根據GenBank已收錄的NDV F基因序列，利用Primer Premier 5.0設計引物，P1：5-ATGGGCTC

CAAACCTTCTACCA-3;P2：5-TCATGCTCTTGCAG

TGGCTCTCAT-3，引物序列由Invitrogen（上海）貿易有限公司合成。

1.4? F基因的克隆及序列測定

1.4.1? NDV基因組RNA的提取? 按TRIzol法提取La Sota毒株（陽性對照）和病料尿囊液的病毒基因組RNA，保存于-80 ℃。

1.4.2? RT-PCR擴增及目的基因的回收純化? 采用NDV特異性引物，經RT-PCR擴增F基因。20 μL反轉錄體系為dNTP mixture 1 μL、Random 6 mers 1 μL、RNA 8 μL。65 ℃水浴5 min，再加入Rnme script II Rtose 0.5 μL、5×Prime script II Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor 0.5 μL、Rnase H2O 5 μL。樣品加好混勻后30 ℃ 12 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，即獲得反轉錄的cDNA。PCR擴增反應體系為2×Taq MasterMix 25 μL、P1 2 μL、P2 2 μL、ddH2O 19 μL、模板cDNA 2 μL，混勻;PCR反應條件為94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，30個循環;72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用普通瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒回收純化PCR產物，產物再次電泳檢測。

1.4.3? NDV F基因的克隆與鑒定? 將回收純化的F基因與pMD18-T載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞，于LB培養基中37 ℃培養過夜，挑取單克隆于含Amp的LB液體培養液中37 ℃振蕩過夜，提取質粒DNA進行PCR鑒定。將陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.5? NDV F基因的分子遺傳變異分析

采用DNA Star等軟件，對分離株與國內外NDV參考株F基因序列進行分析，并繪制進化樹[7-11]。

2? 結果與分析

2.1? 尿囊液血凝性檢測結果

將無菌收集的雞胚尿囊液經雞紅細胞懸液進行直接血凝試驗測定。結果表明，尿囊液具有明顯的血凝性。

2.2? NDV F基因的RT-PCR檢測結果

利用F基因特異性引物對尿囊液進行檢測。結果表明，從尿囊液中擴增出1 700 bp的目的條帶，與預期結果相符（圖1）。

2.3? NDV F基因的序列測定及結果分析

由測序結果可知，該新城疫病毒分離株全長1 662 bp，其編碼的氨基酸序列分析可知，其序列長度符合NDV病毒F基因序列長度，氨基酸裂解位點與NDV強毒株的特征相符。該毒株F蛋白裂解位點區的氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，在氨基酸序列101位和121位為賴氨酸（K）和纈氨酸（V），和基因Ⅶ NDV強毒株的特征性氨基酸一致。

2.4? 核苷酸序列同源性及系統進化樹分析

NDV分離株與國內外參考株F基因的核苷酸序列同源性在84.2%～97.7%（表1）。其系統進化樹分析結果表明，分離株基因序列與基因Ⅶ型參考毒株同源性在87.5%～97.7%，其中與基因Ⅶd型的參考毒株同源性最高為95.4%～97.7%，處于同一分支（圖2）;而與現用疫苗株（La Sota、Clone-30、B1、Mukteswar等）之間的親緣關系較遠，同源性較低，在84.2%～86.6%之間。

3? 討論

F蛋白是NDV感染細胞所必需的，可以促進病毒囊膜與細胞膜的融合，從而使病毒穿入細胞膜，并脫去核衣殼進行復制。研究表明，NDV感染細胞的前提是F蛋白首先被裂解為F1和F2，而F蛋白能否被裂解，取決于F蛋白裂解位點（112-117aa）氨基酸組成和宿主細胞的特性，定點突變技術發現，F蛋白裂解區域的堿性氨基酸殘基數決定了它的裂解能力和毒力，是區分毒力強弱的重要標志[12]。研究表明，所有強毒株的裂解位點一般為112R/K-R-Q-K/R-R-F117，弱毒株的裂解位點一般為112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117[13-15]。序列分析表明，本研究分離的NDV毒株F基因的裂解位點氨基酸排列順序為R-R-Q-K-R-F，是典型的強毒株裂解位點模式。通過NDV新鄉分離株F基因的分子遺傳進化分析表明，該強毒株屬于基因Ⅶ型，且與國內流行的基因Ⅶd型毒株同源性高于95.4%，但是卻與現用疫苗株之間的同源性較低，也是中國新城疫免疫效果差的原因。中國目前流行的新城疫毒株主要為基因Ⅶ型，而這其中基因Ⅶd型新城疫毒株發病率占60%[16-19]。通過本研究結果可知，新城疫新型疫苗的制備需篩選與當前流行株密切相關的毒株作為候選疫苗株，配合常規疫苗免疫，才能更好地控制新城疫的流行，進而減少對中國養禽業的危害。

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