重樓皂苷I對成骨細胞MC3T3-E1增殖及分化的實驗研究*

龐 敏，吳 志△，陳 森，牛銀波，李 勃，林冠杰

1.廣東省湛江市第四人民醫院骨科(湛江524008)，2.西北工業大學生命科學院(西安710072)； 3.武警陜西省總隊醫院(西安710054)

骨質疏松癥是一種以骨骼中礦物質水平明顯降低、骨骼微結構被破壞以及骨骼脆性增加為特征的疾病。隨著我國人口的老齡化，骨質疏松癥已經成為一種嚴重危害中老人身體健康和生存質量的健康問題。2018年，中國衛健委針對骨質疏松癥進行了我國第一次流行病學調查。此次調查結果顯示，年齡超過50歲的人群骨質疏松癥患病率為19.2%，中老年女性骨質疏松問題尤為突出，年齡超過50歲的女性患病率達32.1%，遠高于同齡男性的6%，而年齡超過65歲的女性骨質疏松癥患病率更是達到了51.6%。骨質疏松癥引發的骨折(髖骨、股骨)嚴重影響了病人的生活質量，增加了個人以及國家的醫療負擔，因此，尋找有效的防治措施已經成為醫療科研領域一項亟待解決的問題。 我國的傳統醫學，中醫學對于治療跌打損傷有著豐富的資源以及經驗。重樓又名“七葉一枝花”，為百合科植物，它主要分布在廣西、貴州、四川、廣東等省，有消腫止痛、敗毒抗癌、鎮咳平喘、清熱定驚等作用。研究者們發現，甾體皂苷是其中主要的生物活性成分；并著重研究以及闡明重樓的抗腫瘤作用與相關機制[1-2]。除了抗腫瘤作用外，重樓作為云南白藥的主要成分之一，對骨骼與肌肉的損傷也呈現出良好的效果。因此，重樓皂苷不僅能治療運動系統的損傷，而且可能防治骨質疏松癥的進展。本實驗研究重樓皂苷I(Polyphyllin I，PPL I)對小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖與成熟及其β-catenin與BMP-2蛋白表達的影響，揭示PPL I防治骨質疏松癥的作用并初步探討其可能的防護機制。

材料與方法

1 材料與試劑 PPL I(分子量為855.02，純度>98%)從上海瀚香生物科技有限公司購買。小鼠成骨樣細胞株MC3T3-E1 (中國科學院上海生化細胞所細胞庫)，胎牛血清(美國Thermo Fisher公司)，DMEM培養液(美國Thermo Fisher公司)，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜 (DMSO)、MTT (均購于美國Sigma公司)，骨形態發生蛋白2(BMP-2)，β-連環蛋白(β-catenin)及β-肌動蛋白(β-actin)抗體均購自北京博奧森生物有限公司，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒 (南京建成生物公司)，EdU試劑盒 (廣州瑞博公司)。

2 細胞培養與藥物處理 使用加入10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養液在37℃、5% CO2的條件中培養MC3T3-E1細胞。將PPL I溶解于DMSO中，配置成濃度為1 mol/L的儲藏液。臨用前，將其稀釋成工作濃度(1、3、10、30 μmol/L)。

3 MTT法觀察細胞的增殖 將細胞(2×103/孔)接種于96孔板中，隨后放在細胞孵箱中(5% CO2、37℃)培養12 h。隨機分為正常對照組：每孔中加入200 μl DMEM培養液(含0.54‰ DMSO)；給藥組：每空加入200 μl含PPL I (1、3、10、30 μmol/L) 的培養液。繼續培養1d或2d。每孔加入濃度為5 g/L 的20 μl MTT溶液， 繼續孵育4h，結束培養。吸干培養液，接著每孔加入150 μl DMSO，充分振蕩、完全溶解結晶物。立即使用Bio-Rad ELISA Reader讀取培養板在490 nm波長處的吸光值。計算細胞增殖率：細胞增殖率/% =(試驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。

4 EdU法檢測細胞增殖 細胞培養方法同上 (為了進一步觀察驗證PPL I對細胞增殖的作用，參考MTT結果，選擇3、10 μmol/L兩個促進細胞增殖明顯，且對細胞特性無顯著影響的濃度)，將含不同濃度的PPL I (3、10 μmol/L)培養液孵育、處理MC3T3-E1細胞2d后，參考說明書進行操作，實驗完畢使用奧林帕斯顯微鏡捕捉處理圖像。

5 堿性磷酸酶(ALP) 活性測定 堿性磷酸酶是能夠反映成骨細胞分化程度的一種酶。ALP的活性越高，成骨細胞的成骨活性越強；反之亦然[3]。使用24孔板培養MC3T3-E1細胞(2×104/孔)12 h后，更換含有3、10 μmol/L PPL I的新鮮培養液，繼續培養2 d或3 d。參考堿性磷酸酶試劑盒說明書進行實驗。使用瑞士梅特勒-托利多紫外分光光度計測定各組在520 nm處吸光度；檢測每個樣品的蛋白含量，結果用U/mg 蛋白表示。

6 茜素紅染色 以2×105/孔的密度將MC3T3-E1細胞接種于24孔板內，培養14 d。1次/3d，換用含3、10 μmol/L PPL I的培養液。培養結束后，用預冷PBS 洗滌細胞，70%的酒精固定20 min，吸棄固定液， PBS 清洗細胞樣本兩次。滴加茜素紅 S 染色液(Solarbio公司)， 覆蓋樣本， 染色 5min。吸去染色液， PBS 洗滌2次。顯微鏡下觀察： 鈣沉積陽性細胞呈現桔紅色。

7 免疫印跡法檢測β-catenin與BMP-2的蛋白表達 待PPL I處理細胞2d后，使用細胞刮刮取收集細胞。以RIPA Lysis Buffer(江蘇碧云天公司)提取細胞蛋白，用Bradford 法測定蛋白濃度。確定每孔的蛋白上樣量為30 μg，接著在120 V電壓下，行凝膠電泳，分別使用6%的濃縮膠與12%的分離膠進行樣本的濃縮與分離，采用NC膜進行轉膜。以PBST做溶劑，配置5%脫脂牛奶溶液，在室溫下封閉硝酸纖維素膜2 h后，加入β-catenin (1∶500)、BMP-2 (1∶500)及β-actin (1∶500) 一抗，放入冰箱冷藏室(4℃)中孵育12 h。使用PBST洗膜3次，10 min/次，加入HRP標記二抗(稀釋比例1∶6000)，室溫孵育1 h，充分洗膜后，使用美國Millipore公司的ECL 發光液進行化學發光，采用Bio-Rad凝膠成像儀采集分析條帶。

8 統計學方法 使用單因素方差分析(ANOVA)比較組間差異，選擇SPSS 20.0統計學軟件進行統計學分析，P<0.05表示有統計學差異。

結 果

1 PPL I可促進MC3T3-E1細胞增殖 PPL I(1、3、10、30 μmo/L)作用細胞24 h、48 h后，成骨樣細胞均發生顯著地增殖(P<0.01)(圖1)：重樓皂苷(1、3、10、30 μmol/L)作用24 h后，MC3T3-E1細胞的增殖率分別為(111. 67 ± 2.52)%、(122. 00 ± 4.58)%、 (130. 33 ± 3.06)%、(142. 00 ± 2.65)% ；48 h后，分別為(123. 33 ± 3.51)%、( 132. 67 ± 2.08)%、(141. 00 ± 2.00)%、(146. 67 ± 3.21)%。 EdU實驗結果(圖2)也顯示，PPL I可以有效地促進MC3T3-E1細胞的增殖。

2 PPL I可上調MC3T3-E1 細胞的ALP活性 將PPL I (3、10 μmol/L)加入培養液，處理細胞 1 d或2d后，細胞中的堿性磷酸酶(ALP)活性均明顯上調。在2d與3d時，正常組細胞的ALP活性分別為(0.22 ± 0.01)、(0.23 ± 0.02) U/mg蛋白。而PPL I(3、10 μmol/L)作用1d后，ALP活性分別為(0. 31 ± 0.03)、(0. 34 ± 0.03)U/mg蛋白；2d后，分別為(0.40 ± 0.04)、(0.51 ± 0.03) U/mg蛋白。與對照組相比，均有顯著升高(圖3)。

圖1PPL I對MC3T3-E1細胞增殖的影響(與對照組24 h比較，**P<0.01；與對照組48 h比較，##P<0.01)

圖2 EdU檢測PPL I對MC3T3-E1細胞增殖的影響 (×100，紅色信號顯示處于增殖狀態的細胞，藍色信號顯示細胞核)

圖3 PPL I對MC3T3-E1細胞的堿性磷酸酶活性影響(與對照組48 h比較，**P<0.01；與對照組72 h比較，##P<0.01)

圖4 PPL I對MC3T3-E1細胞鈣結節(橘紅色結節即為鈣結節)形成的影響

3 PPL I可促進MC3T3-E1 ALP細胞的成熟 鈣沉積和鈣化結節的形成是成骨細胞成熟的一種標志。 茜素紅S鈣染色法是一種通過鰲和技術，使鈣離子和茜素紅 S 結合形成復合物，進而分析細胞樣本中橘紅色鈣沉積現象的經典方法。如圖4所示，PPL I(3、10 μmol/L)作用2周后，MC3T3-E1細胞的鈣結節形成明顯增高。

4 PPL I可促進MC3T3-E1細胞中β-catenin和BMP-2的蛋白表達 免印跡疫結果顯示，PPL I (3、10 μmol/L) 作用48 h后，MC3T3-E1細胞中β-catenin和BMP-2的表達呈濃度依賴性地升高 (圖4)。

圖5PPL I影響MC3T3-E1細胞β-catenin與BMP-2蛋白表達水平(與對照組比較，**P<0.01)

討 論

骨質疏松癥已經成為世界范圍內的一個嚴重問題。其發病率高居各種疾病的第七位 ，且呈現出逐年增高趨勢，該病在65歲以上老年人群中的發病率≥50%[4-6]。骨質疏松早期通常沒有明顯的臨床表現，假如不引起重視，隨著病情的進展可引發疼痛、脊柱變形和骨折等情況。其嚴重并發癥是骨折，常見的骨折部位是腰背部、髖部和手臂，致殘致死率高，嚴重影響患者生活質量。骨質疏松癥的防治已經成為一個亟待解決的問題。

重樓是我國的傳統藥材，是云南白藥的主要成分之一，在消腫止痛與抗跌打損傷方面有良效。藥理學研究發現本品提取物有止血、抗炎、鎮靜鎮痛等功效[1]。重樓中含量最為豐富的一種成分是甾體皂苷，其數量約占所有化合物的80%。因此，我們認為：重樓皂苷不僅能治療運動系統的損傷，而且可能防治骨質疏松癥的進展。

該實驗中，MTT結果顯示：PPL I可時間、濃度依賴性地促進成骨樣細胞MC3T3-E1增殖。EdU試驗結果也再次提示PPL I可有效地促進MC3T3-E1細胞增殖。接著，我們通過檢測ALP的變化來研究PPL I調節MC3T3-E1細胞的成骨活性的作用。觀察到，PPL I明顯地升高了細胞中的ALP活性。成骨細胞，在骨基質的合成、分泌和礦化扮演了重要角色，是骨發生與形成的主要功能細胞。茜素紅染色實驗表明，PPL I可以顯著地促進成骨細胞成熟，表現為鈣結節形成增多。上述實驗表明，PPL I影響調節成骨細胞的增殖與成熟有可能是重樓修復骨骼與肌肉損傷的機制之一。接著，本實驗采用分子生物學手段，觀察與研究PPL I究竟是怎樣影響MC3T3-E1細胞的增殖及分化，以便為重樓與重樓皂苷未來應用于防治骨質疏松的領域，提供一定的理論基礎。

Wnt/β-catenin信號通路在骨形成及骨代謝中發揮了重要作用：β-catenin一旦從細胞質進入到細胞核內，即可激活Wnt通路下游的一系列靶基因，隨后十分重要地參與調控成骨細胞的增殖、分化與成熟[7-9]。骨形態發生蛋白(BMPs)，可調控成骨細胞的增殖、分化和凋亡，能夠誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，十分重要地參與調控成骨細胞的分化過程[10-12]。免疫印跡結果表明，PPL I明顯地促進了MC3T3-E1細胞中β-catenin與BMP-2的蛋白表達。提示PPL I促進成骨樣細胞MC3T3-E1增殖的作用機制之一與其影響Wnt/β-catenin與BMP-2的通路有關。

綜上所述，實驗發現PPL I可促進成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖與分化，并上調其成骨活性；PPL I升高了β-catenin和BMP-2的蛋白表達。參考文獻以及實驗結果：成骨細胞在運動系統損傷修復中發揮了重要作用。我們認為PPL I發揮促損傷修復的可能作用機制之一在于，它能促進成骨細胞的增殖與分化。盡管，PPL I的骨保護作用仍需進一步闡明，然而本研究結果為PPL I在運動系統的損傷修復以及抗骨質疏松中的應用提供了一定實驗線索與依據。