不同性別MTHFR基因多態性協同葉酸水平差異對血清同型半胱氨酸的影響研究

舒 放，王海峰，薛飛肖，寧 可，史珊珊，呂海港

1.西安市第三醫院檢驗科(西安 710018)；2.西安市紅會醫院麻醉科(西安 710054)

始于1976年的眾多流行病學研究表明，高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia，HHcy)是心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVDs)的獨立危險因素[1]。同型半胱氨酸(Hcy)是氨基酸半胱氨酸的異種，其代謝作用有兩種途徑：再甲基化和轉硫作用。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是再甲基化循環中的關鍵調控酶[2]，在Hcy代謝過程中起到重要作用。人MTHFR催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原(5,10-MTHF)為5-亞甲基四氫葉酸(5-MTHF)，5-MTHF是同型半胱氨酸甲基化成蛋氨酸中起重要作用的因子。人類MTHFR基因位于染色體1p36.3，全長1980bp，MTHFR基因第4外顯子上的第677位核苷酸(C677T，rs1801133)的胞嘧啶(C)替代胸腺嘧啶(T)是一個常見的MTHFR基因多態性[3]，由此存在三種基因型：MTHFR C677C(野生型)、MTHFR C677T(雜合突變型)、MTHFR T677T(純合突變型)，突變使得再甲基化循環障礙，從而導致Hcy在體內蓄積，血清Hcy水平升高[4]。有研究表明， 血清Hcy水平易受B族維生素(葉酸、維生素B12和維生素B6)調節[5]。葉酸缺乏亦會提高Hcy水平和高同型半胱氨酸血癥的發病率[6-7]。此外，補充葉酸有助于降低高Hcy濃度的毒性并受到MTHFR基因型調控[8-9]。本文著重探討葉酸缺乏合并Hcy代謝基因多態性對血清Hcy水平的影響以及性別因素的差異性。

材料及方法

1 標本采集 篩選西安市第三醫院2017年2-7月間住院病人病例共88例，其中男性39例，女性49例，年齡18～85歲，均來自健康管理中心。收集病例年齡、性別、血壓、等數據。血清學檢測排除溶血、嚴重脂血、黃疸等影響因素。

2 血清學檢測 早8:00-9:00間采集靜脈血4ml，3000r/min離心15min，分離血清，4℃可保存3d，長期保存需-20℃凍存。Beckman AU5800全自動生化分析儀檢測血清葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、Hcy，以上檢測項目需離心后2 h內檢測； Unicel DXI 800化學發光分析儀檢測血清葉酸(Fol)。樣本檢測當日儀器均運行正常，質控在控，CV<5%。

3 MTHFR基因多態性檢測

3.1 全血基因組DNA提取試劑盒分離全血中的基因組DNA。

3.2 每人分做兩個反應體系，分別含有C677T基因突變型特異引物及野生型特異引物。每個反應體系包括29μl擴增液、1μl反應液(含Taq DNA酶、UNG酶)、3μl待測基因組DNA、17μl ddH2O補至總體積50μl。

3.3 等位基因特異性聚合酶鏈反應(Allele Specific PCR,AS-PCR)。Roche cobas?480全自動熒光定量PCR分析儀進行基因擴增。擴增程序為50℃ 2min；95℃ 5min；94℃ 30s、60℃ 30s、65℃ 1min(26Cycles)；65℃ 10min；4℃ Hold。

3.4 將兩管擴增產物分別滴在檢測卡對應的樣品墊處，2～5min根據在線檢測線(T線)是否出現條帶判讀C677T位點的基因型。C/C為野生型，C/T為雜合突變型； T/T為純合突變型。

4 統計學方法 應用SSPS19.0統計學軟件，t檢驗分析不同性別基本臨床參數(Glu、TG、BP、Hcy、Fol)差異性及MTHFR基因多態性分布差異；不同性別MTHFR基因多態性合并血清葉酸不同水平時血清Hcy水平差異性。

結 果

1 不同性別基本臨床參數的比較 見表1。基本參數如血壓、Glu、TG、TC在不同性別間比較均無統計學差異(P>0.05)，Fol水平在不同性別間有統計學差異性(P<0.05)，女性Fol高于男性。

2 不同性別MTHFR基因多態性分布 見圖1。 C/C野生型占14.8%，C/T雜合突變型占47.7%；T/T純合突變型占37.5%，不同性別間比較無統計學差異(P>0.05)。

3 MTHFR C677T基因多態性Hcy、Fol水平比較 見表2。三種MTHFR基因多態性樣本組間血清Hcy水平比較有統計學差異。

4 不同性別MTHFR基因多態性合并葉酸缺乏者血清Hcy水平比較 見表3。不同性別葉酸缺乏組間血清Hcy水平比較，有統計學差異。

表1 不同性別基本臨床參數

注：本組不同性別比較，*P值<0.05

表2 MTHFR基因多態性合并血清葉酸不同水平時血清Hcy水平比較

注：Fol測定值≥5.9nmol/L入Fol不缺乏組，<5.9nmol/L入Fol缺乏組；與Fol缺乏組比較，*P<0.05

表3 不同性別MTHFR 基因多態性合并葉酸缺乏者Hcy水平比較

注：與本組不同性別比較，*P<0.05

圖1 不同性別MTHFR基因多態性分布

討 論

HHcy可能導致動脈粥樣硬化這一觀點最初是1969年由Mc Cully在一項對兒童蛋氨酸代謝障礙的研究中首次提出[10]。此后，幾十年來，許多研究試圖揭示Hcy對CVDs的致病機理以及探討這種相關性是否適用于不同人群[11-13]，目前絕大多數的研究都證實了這一觀點。而另一些研究觀點認為Hcy可能是CVDs的標志物而不是誘因[14]。此外，其他一些臨床及流行病學研究發現異常HCY也可能在糖尿病、內皮功能障礙、先天性缺陷和認知障礙的過程中發揮作用[15-16]。MTHFR 677基因多態性還同復發性流產(Recurrent pregnancy loss，RPL)密切相關，其中基因位點C→T突變可造成孕婦血同型半胱氨酸水平上升，造成胎兒發育障礙，引起流產風險上升[17]。

MTHFR是調節Hcy代謝的關鍵酶，其中677基因位點突變造成MTHFR的一個基因多態性(SNP rs1801131)。從人外周血細胞中提取基因組DNA的方法，通過對等位基因MTHRF C677T基因突變位點的引物設計及標記，利用等位基因特異性聚合酶鏈反應(Allele Specific PCR,AS-PCR)方法擴增獲得特定的擴增片段，標記有地高辛分子的PCR產物在與所構建的基因分型檢測體系中納米金磁微粒表面抗地高辛單抗相互作用，通過側向流層析技術實現MRHFR C677T基因多態性的檢測。相應的中國人群MTHFR 677純合突變率高達29%，雜合突變高達44%，正常MTHFR 677CC基因型(野生型)僅占27%。無論是雜合突變(677CT)或純合突變(677CC)都造成酶活性的減低，從而影響Hcy代謝，造成體內堆積。血漿Hcy水平受遺傳和環境因素的影響。而在這些因素中，血清葉酸是同型半胱氨酸升高最強的獨立因素。臨床研究顯示，葉酸口服可有效治療高同型半胱氨酸血癥[18]。故葉酸的缺乏被認為是心血管疾病的一個危險因素。除此之外，米蔓麗等[19]研究指出，可對RPL患者同時進行MTHFR基因多態性和空腹同型半胱氨酸篩查，以對其流產風險進行評估，并及早采取干預措施。

本研究中，受試者年齡、收縮壓、舒張壓、Glu、TG、TC等連續變量均為平均數±標準差。血清Hcy水平高于15μmol/L被定義為HHcy[20]，血清葉酸水平低于5.9 nmol/L作為葉酸缺乏判斷標準。與女性相比，男性表現出較高的收縮壓、舒張壓及血清Hcy水平(P<0.05)，較低的血清葉酸水平(P<0.05)。與MTHFR 677CC 及 MTHFR 677CT攜帶者相比，MTHFR 677TT基因型的患者有較高的血清Hcy水平(P<0.05)。不同性別MTHFR基因C677T多態性聯合葉酸缺乏對Hcy水平的影響主要體現在T677T型別，由于這種純合突變本身更易造成葉酸代謝障礙，從而導致Hcy水平升高。結合性別因素，男性較女性葉酸水平整體偏低，葉酸水平及MTHFR 677基因型二者共同影響下造成男性MTHFR基因純合突變者其血清Hcy水平與女性比存在顯著性差異。而在MTHFR基因多態性C677C和C677T兩型受檢者的血清Hcy無明顯性別差異性，原因除了該兩種基因型決定了葉酸代謝水平應比T677T型高外，環境因素和飲食因素可能在葉酸攝取及Hcy水平方面也起到一定作用，弱化了該兩種基因型的血清Hcy在性別間的差異性。

綜上所述，MTHFR 677三種基因型中純合突變(TT)型者更易造成血清Hcy代謝障礙，此類型的基因型個體合并葉酸缺乏者其血清Hcy升高。故MTHFR T677T型尤其是男性更應注重葉酸的攝取及補充，降低HHCY的風險概率。