六溴環十二烷(HBCD)對H4細胞和SK-N-AS細胞脫碘酶2和3表達的影響

郝小吉，尚小娜,3，于海華，么建萍，韓璐，劉曉暉，李亞晨,#，邵靜,*

1. 大連醫科大學公共衛生學院，大連市血液病重點實驗室，遼寧省造血干細胞移植醫學中心，遼寧省造血干細胞移植臨床轉化醫學研究重點實驗室，大連 116044 2. 大連市婦幼保健院，大連 116033 3. 康龍化成(北京)新藥技術股份有限公司，北京 100176

六溴環十二烷(hexabromocyclododecane, HBCD)是一種高溴含量的脂環族添加型阻燃劑，與多溴聯苯醚(PBDEs)均屬于溴系阻燃劑(BFRs)，作為PBDEs替代物被廣泛使用，同樣應用于電子、電器、化工、交通、建材、紡織、石油和采礦等領域。與PBDEs類似，HBCD易于從產品中游離、釋放到環境介質中，具有持久性和蓄積性，從而成為一種新型環境有機污染物[1-2]。有研究認為，HBCD可能與PBDEs形成復合污染體系，二者共同作用，對人類健康造成潛在危害[3]。

HBCD毒性作用主要表現為肝臟損傷[4]、內分泌干擾[5-6]和神經毒性[7]等方面。尤其，處于腦發育期的嬰幼兒及兒童是HBCD及HBCD/PBDEs復合污染物暴露的高風險人群。HBCD誘導的發育神經毒性效應主要來源于神經發育時期[8]。研究表明，HBCD引起發育神經毒性的機制可能與2個因素有關：(1)引起腦局部神經細胞損傷，而直接影響神經系統發育；(2)通過影響腦局部甲狀腺激素水平，間接影響神經發育水平，但二者的聯系機制尚不清楚。

機體不同組織細胞對甲狀腺激素的生理需求不同，需要對來自循環的甲狀腺激素在局部細胞中進行調節，使組織局部甲狀腺激素并不完全依賴外周循環水平。組織中脫碘酶(deiodinase, Dio)對此起著關鍵作用。Dio是一組含硒蛋白酶，分三型(Dio1、Dio2和Dio3)，各自以獨特的脫碘方式調節其所分布組織細胞內甲狀腺激素(thyroxine, TH)的生物活性。Dio2功能是通過外環脫碘在細胞內將四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine, T4)轉化為活性三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine, T3)，并通過特異的T3受體發揮生物功能，在機體生長發育中起重要作用，是哺乳動物胚胎中主要的脫碘酶[9]；在腦組織中，Dio2主要分布于神經膠質細胞中[10-11]。Dio3主要分布于神經元細胞，特別是胎腦、1月齡以內的嬰兒皮膚、胎盤和胎兒腸組織中，是通過內環脫碘將細胞外T4和T3分別轉化為無活性的反三碘甲狀腺原氨酸(reverse triiodothyronine, rT3)和二碘甲狀腺原氨酸(diiodothyronine, T2)，調節組織細胞內T3水平，避免發育中的胎兒和胎兒組織暴露于高濃度活性甲狀腺激素中[11-12]。Dio1具有內、外環脫碘的雙重活性，可在外周組織中清除rT3，并介導血清T3生成[13-14]。

作為環境有機污染物神經毒性研究的一部分，本研究以人腦神經母細胞瘤細胞(SK-N-AS)和人神經膠質瘤細胞(H4)作為體外生物模型，初步探討HBCD對2種神經細胞的細胞毒性，以及對2種脫碘酶在不同細胞中表達特征的影響，明確Dio2和Dio3在HBCD誘導神經毒性中的作用，以期探索孕期HBCD暴露是否通過影響胚胎腦局部脫碘酶表達、調控局部甲狀腺激素水平，進而導致子代神經系統發育損傷。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與材料

HBCD(純度95%，美國Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司，北美)，DMEM低糖、高糖培養基(Hyclone公司，美國)，兔抗人多克隆抗體Dio2、Dio3及BDNF腦源生長因子ELISA試劑盒(Abcom公司，美國)，Dio2和Dio3基因引物、RNA提取及反應試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM( TaKaRa公司，日本)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染彩色蛋白分子量Maker、RIPA裂解液、四甲基乙二胺(TEMED)等(碧云天生物技術有限公司，北京)，HRP標記的羊抗兔二抗(Proteintech公司，美國)，ECL檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，氯仿、乙醇和異丙醇等均為分析純，分別購自天津市科密歐化學試劑有限公司和天津市化學試劑一廠。SK-N-AS、H4細胞來自美國ATCC細胞庫。

1.2 儀器

細胞培養箱(Thermo 3111，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，354型多功能酶標儀(Thermo公司，美國)，CKX41型倒置相差熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，電泳系統(EPS-300，上海天能)，梯度PCR儀(T100TM Thermal Cycler，美國Bio-RAD公司)，實時PCR系統(Takara Thermal Cycler Dice TP800，寶生物公司)，高速冷凍離心機(HERMLE公司，德國)，化學發光凝膠成像系統(UVP公司，美國)，Biodropsis超微量核酸分析儀(BD-1000，北京五洲東方科技發展有限公司)。

1.3 樣品采集及指標檢測

1.3.1 細胞的復蘇及培養

將凍存的SK-N-AS、H4細胞復蘇，SK-N-AS用DMEM低糖培養基，H4用DMEM高糖培養基培養，其中各加入10%的胎牛血清及1%的青-鏈霉素雙抗，將細胞放置于37 ℃、5% CO2培養箱中，待細胞融合將近80%時，用0.25%胰酶消化為細胞傳代，培養過程中及時換液，保證細胞生長狀態良好。

1.3.2 MTT檢測細胞存活率

收集對數生長期的細胞，調整細胞懸液濃度為8×104個·mL-1，鋪于96孔板底100 μL·孔-1，設置5個復孔。置37 ℃、5% CO2培養箱中培養8～24 h，棄清液；加入不同濃度HBCD(0、1、3、9 μmol·L-1)，100 μL·孔-1，置37 ℃、5% CO2培養箱染毒24 h，棄清液；每孔加100 μL新鮮配制的MTT應用液，繼續置37 ℃、5% CO2培養箱中2 h，棄清液；每孔加100 μL二甲基亞砜(DMSO)，置37 ℃、5% CO2培養箱中1 h，使結晶物充分溶解。用酶標儀于波長595 nm測定各孔OD值，計算細胞在不同濃度下的存活率。保證實驗條件的穩定性，結果重復3次以上。

1.3.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測脫碘酶Dio2和Dio3基因表達

取生長對數期的SK-N-AS、H4細胞，分別用0、1、3和9 μmol·L-1HBCD處理24 h，用TransZol Up試劑盒提取總RNA，超微量核酸分析儀分析RNA的純度，保證無污染及降解。Dio2、Dio3以及GAPDH基因引物序列見表1。將1 μg的總RNA逆轉錄成cDNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit的說明操作，具體反應步驟如下：首先去除基因組DNA(表2)，再進行反轉錄(表3)，然后按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明，構建qRT-PCR的反應體系(表4)。反應在八聯管中進行，置于PCR儀上進行實時熒光定量反應。PCR反應條件為：預變性95 ℃、30 s；95 ℃、3 s，60 ℃、30 s，循環40次；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s；每次實驗均設置陰性對照，檢驗引物質量。觀察目的基因的擴增曲線及溶解曲線，需滿足特異性及靈敏性的要求，以GAPDH的表達量對結果進行標準化，實驗重復3次以上。

表1 引物GAPDH、Dio2、Dio3的基本參數Table 1 Parameters of GAPDH, Dio2, Dio3 genes

表2 去除基因組DNA反應Table 2 Reaction for eliminating the genomic DNA

1.3.4 Western Blot檢測Dio2和Dio3蛋白表達

取生長對數期的SK-N-AS、H4細胞，調整細胞濃度為2×105個·mL-1，鋪于10 cm的培養皿中，分別用0、1、3、9 μmol·L-1HBCD處理24 h。(1)提取總蛋白及定量保存：用RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白定量，用蛋白變性劑及煮沸的方法使蛋白變性。(2)電泳分離蛋白及免疫印跡：按表5分別配制12%分離膠和5%濃縮膠，上40 μg的蛋白樣品。電泳條件為恒壓100 V、90 min；根據預染彩色蛋白分子量Maker，切取所需的蛋白凝膠，采用槽式濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為恒流220 mA、90 min。(3)封閉：5%脫脂奶粉封閉2 h。(4)孵育一抗：用1%的脫脂奶按1：400、1：200和1：1 000的比例分別稀釋Dio2、Dio3和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜。(5)孵育二抗：取一抗孵育的PVDF膜，搖床上TBST洗膜3×10 min，用1%的脫脂奶按1：2 000、1：3 000分別稀釋HRP標記的二抗，室溫孵育2 h。(6)顯影：用TBST洗膜3×10 min，按ECL檢測試劑盒用UVP化學發光凝膠成像系統檢測蛋白的相對表達量。

表3 反轉錄反應Table 3 Reaction for reverse transcription

表4 qRT-PCR反應體系Table 4 qRT-PCR reaction

1.3.5 HBCD對H4細胞BDNF分泌的影響

星形膠質細胞(例如H4)分泌的生長因子包含纖維細胞生長因子(bFGF)、內皮生長因子(EGF)、IL-6和BDNF等，不僅影響星形膠質細胞的生長狀態，還影響神經元細胞的分裂、分化和遷移、樹突和軸突的生長及突觸的生成等。其中，BDNF是一種促進受損傷的神經元再生及分化的營養因子，在正常大腦中，介導膠質細胞與神經元細胞之間的相互影響。本實驗通過檢測HBCD對H4細胞分泌BDNF水平的影響，即細胞上清液中BDNF含量，可初步了解在神經元和膠質細胞共培養體系中或體內生理條件下，HBCD對2種細胞相互作用的改變。

具體方法：細胞經0、1、3和9 μmol·L-1HBCD處理24 h后，收集細胞存活率實驗中結果穩定且有意義的細胞上清液，保存于-80 ℃，用于檢測BDNF含量，上清經2 000 r·min-1去除細胞碎片，按照ELISA試劑盒的說明進行實驗，每個染毒濃度設置3個復孔，每次實驗均制作標準曲線，準確計算上清中BDNF的含量。

表5 分離膠(12%)和濃縮膠(5%)的配制Table 5 Preparation of separation gel (12%) and stacking gel (5%)

注：SDS表示十二烷基硫酸鈉，APS表示過硫酸銨，TEMED表示N,N,N',N'-四甲基乙二胺。

Note: SDS stands for sodium dodecyl sulfate; APS stands for ammonium persulfate; TEMED stands for N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine.

1.4 統計分析

結果表示為均值±標準差(Mean±SD)，用Graph Prism 7.0進行統計分析和制圖。用單因素方差分析(ANOVA test)進行組間比較，方差不齊則用Dunnett’s T3直接進行多重比較。*表示，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

2 結果(Results)

2.1 HBCD對SK-N-AS細胞生存率及脫碘酶表達的影響

2.1.1 細胞生存率

人神經元細胞SK-N-AS細胞分別暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h，以MTT法檢測細胞活力，發現其存活率下降，并具有一定劑量依賴性。由圖1可知，與對照組比較，1、3和9 μmol·L-1HBCD染毒組細胞存活率分別為對照組的89%、76%和53%，其中3和9 μmol·L-1HBCD染毒組具有統計學意義(P<0.05)。

2.1.2 Dio3基因和蛋白表達

腦局部神經元主要表達Dio3，因此，本研究考察HBCD對SK-N-AS細胞中Dio3基因和蛋白表達的影響。細胞暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h后，用qRT-PCR法分析SK-N-AS中Dio3基因表達水平，由圖2可知，低劑量HBCD使Dio3表達略有下降，而高劑量(9 μmol·L-1)則引起Dio3表達顯著上調(P<0.05)。

WesternBlot分析Dio3蛋白表達水平。由圖3可知，Dio3的蛋白表達水平變化與基因基本相似，低劑量組略有下降趨勢，而9 μmol·L-1組則明顯上調(P<0.05)。

2.2 HBCD對H4細胞生存率、脫碘酶表達和BDNF分泌的影響

2.2.1 細胞生存率

人神經膠質細胞H4細胞分別暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h，以MTT法檢測細胞活力。與SK-N-AS細胞相似，H4細胞存活率下降，并具有一定劑量依賴性。由圖4可知，與對照組比較，1、3和9 μmol·L-1HBCD染毒組細胞存活率分別為對照組的～80%、69%和60%，其中3和9 μmol·L-1HBCD染毒組具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 HBCD對SK-N-AS細胞Dio3基因表達的影響Fig. 2 Effect of HBCD on Dio3 gene expression in SK-N-AS cells

圖3 HBCD對SK-N-AS細胞Dio3蛋白表達的影響Fig. 3 Effect of HBCD on Dio3 protein expression in SK-N-AS cells

圖4 HBCD對H4細胞存活率的影響Fig. 4 Effect of HBCD on cell viability of H4 cells

2.2.2 Dio2基因和蛋白表達

腦局部神經膠質細胞主要表達Dio2，本研究考察HBCD對H4細胞中Dio2基因和蛋白表達的影響。細胞暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h，用qRT-PCR法分析H4細胞中Dio2基因表達變化。由圖5可知，HBCD引起基因表達下調，且具有劑量依賴性，其中，3和9 μmol·L-1組有統計學意義(P<0.05)。

Western Blot分析H4細胞中Dio2蛋白表達水平。由圖6可知，HBCD對Dio2蛋白表達的影響與對基因表達影響一致，亦可引起蛋白表達下調，且具有劑量依賴性，其中，3和9 μmol·L-1組有統計學意義(P<0.05)。

2.2.3 對BDNF分泌的影響

H4細胞暴露于0、1、3和9 μmol·L-1HBCD 24 h，ELISA分析細胞外BDNF蛋白含量，由圖7可知，HBCD暴露可致H4細胞分泌的BDNF蛋白明顯減少，其中，3和9 μmol·L-1HBCD組與對照組相比有統計學意義(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

環境有機污染物對甲狀腺激素水平影響已成為發育神經毒性研究的重點之一，甲狀腺激素對腦發育的影響逐漸受到重視。甲狀腺激素水平的相對穩態主要是靠下丘腦-腺垂體-甲狀腺軸(HPT軸)調控。HPT軸是一個復雜的甲狀腺激素(TH)代謝和作用調節網絡，TH受體、脫碘酶、甲狀腺素轉運蛋白(TTR)和鈉碘轉運體被認為是重要的功能基因參與TH合成、運輸、代謝和發揮生物活性[15]，并且可能是暴露于環境污染物的生物體甲狀腺破壞的敏感分子生物標志物[16-17]。

圖5 HBCD對H4細胞Dio2基因表達的影響Fig. 5 Effect of HBCD on Dio2 gene expression in H4 cells

圖6 HBCD對H4細胞Dio2蛋白表達的影響Fig. 6 Effect of HBCD on Dio2 protein expression in H4 cells

圖7 HBCD對H4細胞BDNF分泌的影響Fig. 7 Effect of HBCD on BDNF secretion in H4 cells

HBCD與PBDEs均具有內分泌干擾作用，其中，孕期PBDEs對甲狀腺激素的干擾作用，已在動物實驗研究中得到證實，主要表現為血液中T4濃度降低。脫碘酶是甲狀腺激素代謝中最重要的轉化酶，對維持機體甲狀腺激素水平起著決定作用。脫碘酶不僅參與甲狀腺激素的合成與活化，而且對甲狀腺功能具有重要的調節作用。組織中脫碘酶對來自循環的甲狀腺激素在局部細胞中的調節起著關鍵作用。筆者課題組的前期研究發現，孕哺期BDE 209暴露能夠影響出生后子代甲狀腺激素脫碘酶基因的表達，同時伴有學習記憶能力下降[18]。由于HBCD與PBDEs和甲狀腺激素結構不相似，因此，HBCD被認為具有較低干擾甲狀腺軸的可能性。然而，最近研究表明，HBCD與PBDEs一樣可干擾生物體內甲狀腺穩態[5,19]，從而影響機體生長發育，特別是腦的正常發育。

研究證實，HBCD暴露能夠影響脫碘酶的活性和基因表達，從而干擾生物體內甲狀腺穩態。Palace等[20]研究發現，虹鱒魚用含HBCD飼料喂養32 d后，肝臟Ⅱ型外環脫碘酶活性顯著升高，而虹鱒魚幼魚經HBCD暴露后，血漿游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)和游離甲狀腺素(free tetraiodothyronine, FT4)水平改變，14 d后肝微粒體T4外環脫碘酶(T4ORD)活性未受到影響，但56 d后T4外環脫碘酶活性顯著降低。劉園園等[21]研究發現，腦發育期大鼠，經HBCD暴露后，血清中總甲狀腺素(total tetraiodothyronine, TT4)、總三碘甲狀腺原氨酸(total triiodothyronine, TT3)、FT4、FT3濃度隨著暴露劑量增大呈現先升高后下降的趨勢，并且肝臟D1活性及基因表達水平和腦D2活性及基因表達水平均呈下降趨勢。García等[22]研究發現，循環T3和T4通過改變Ⅱ型脫碘酶活性影響脫碘作用的速度。此外，HBCD暴露可通過增強葡萄糖苷酸化來提高甲狀腺激素的分泌[23]，通過增強組織結合能力[24]或增強脫碘和消除作用[21]提高甲狀腺激素從循環中的攝取，這些都能影響循環甲狀腺激素的水平，繼而影響脫碘酶活性。這些研究顯示了HBCD對甲狀腺激素代謝過程影響的復雜性。HBCD暴露是直接影響脫碘酶轉錄或翻譯，還是通過改變外周甲狀腺激素水平間接影響脫碘酶尚不能確定。本研究中，筆者調查了HBCD對H4人腦神經膠質瘤細胞Ⅱ型脫碘酶(Dio2)和SK-N-AS人神經母細胞瘤細胞Ⅲ型脫碘酶(Dio3)表達的影響，結果顯示，HBCD以劑量依賴方式降低H4細胞和SK-N-AS細胞生存率，引起H4細胞Dio2蛋白和基因表達下調，而致SK-N-AS細胞Dio3蛋白和基因表達上調。這些結果提示，HBCD可能通過抑制Dio2的表達，減少腦細胞內由T4向T3的轉化，而通過增加Dio3的表達，將細胞外T4和T3分別轉化為無活性的rT3和T2，從而使腦局部T3水平降低，影響腦發育。為明確HBCD對脫碘酶表達的影響是否對局部T3、T4水平有干擾作用，本研究試圖檢測SK-N-AS和H4這2種細胞上清液中T3、T4和rT3含量，但由于體外表達和分泌量很低，檢測結果非常不穩定，筆者課題組未來將在體內研究中探討HBCD對脫碘酶以及T3、T4的毒理學效應。

另外，值得注意的是，本研究發現，HBCD對SK-N-AS中Dio3表達具有濃度效應，在低濃度下致Dio3表達略有下降，盡管未見統計學意義，而在高濃度下則致Dio3表達顯著增高。Dio3是細胞表面受體，環境有機污染物在低濃度下對其RNA或蛋白表達影響不明顯，但可能通過氧化應激、經由其他生物分子而改變Dio3結構和功能，從而影響局部甲狀腺激素水平[25-27]。而在高濃度下，環境有機毒物可能通過甲基化或microRNA調控Dio3表達，影響局部組織甲狀腺激素水平，從而可能引起神經系統損傷[28]。

神經營養因子如腦源性神經營養因子(BDNF)在TH介導的腦發育中起關鍵作用[29]。在腦發育中，BDNF廣泛涉及神經元增殖和分化[30]，特別是BDNF促進神經突遷移和伸長[31]。此外，小鼠BDNF基因缺失顯示的腦發育異常類似于甲狀腺功能減退的動物[32]。BDNF表達在甲狀腺機能減退的小鼠中也受到抑制[33]。Ibhazehiebo等[34]報道BDNF能緩解HBCD引起的甲狀腺激素誘導的顆粒細胞軸突延長抑制。因此，本研究初步探討HBCD對H4細胞BDNF分泌的影響，結果顯示，HBCD可以降低H4細胞BDNF的分泌，而BDNF降低，很可能加劇HBCD對神經元的損傷，或阻礙神經元的修復和再生過程。筆者課題組今后將在SK-N-AS和H4這2種細胞共培養體系以及在體內研究中，進一步探討BDNF和其他生長因子在HBCD神經毒性中的作用。

綜上，本研究結果表明，HBCD暴露可能通過影響胚胎腦局部脫碘酶表達、調控局部甲狀腺激素水平，影響BDNF的分泌，導致子代神經發育異常。下一步將進行動物實驗，研究孕期HBCD暴露對胚胎腦局部脫碘酶表達的影響及甲狀腺激素水平的調控，以闡明HBCD引起子代神經發育毒性的機制。