GO通過氧化損傷激活秀麗線蟲未折疊蛋白反應

趙云利，洪運，李佳鈺，李仁杰，吳華彰

1. 蚌埠醫學院公共衛生學院，蚌埠 233030 2. 蚌埠醫學院生命科學系，蚌埠 233030

氧化石墨烯(graphene oxide, GO)是石墨粉末化學氧化及剝離后的產物，通常為單一原子層的薄層。由于其獨特的光、電等特性，以及低廉的生產成本，在生物醫藥、電子元件和復合材料等領域嶄露頭角、應用前景誘人[1]。然而，氧化石墨烯在給人類帶來巨大經濟利益和技術突破的同時，也對人類健康與環境安全產生了潛在的威脅[2]。體內外研究顯示GO具有潛在毒性效應：進入動物體內的GO可以分布聚集在腸道、肝臟、腎臟和肺等組織部位，通過誘導血栓的形成、基因表達改變、線粒體損傷和炎癥反應等對動物產生損傷[3-5]；體外研究證實，GO可以降低細胞活力，誘導caspase-3活性增高、乳酸脫氫酶(LDH)釋放和活性氧(ROS)的產生，進而導致細胞粘附性改變與凋亡的產生[4,6-8]。因此，GO毒作用機理被認為與氧化應激發生有關。

在正常的生理狀態下，人體內的氧化與抗氧化體系處于動態平衡之中。但是，當機體處于饑餓、理化因素刺激等不利環境時，機體內的這種平衡被打破，自由基、ROS等在機體內累積，導致氧化損傷[9]。機體內自由基產生過量時，會攻擊脂類、蛋白質和DNA等人體的生物大分子，使其結構遭到破壞[9]。這時，機體可能通過未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)來應對錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂所帶來的傷害[10]。已有研究顯示納米材料可以誘導UPR：納米金可以激活內質網PERK信號通路和UPR信號跨膜感受蛋白肌醇依賴酶1(IRE1)誘導細胞凋亡，納米銀通過caspase-4降解UPR信號跨膜轉錄因子6(ATF-6)、通過非經典信號通路誘導秀麗線蟲UPR應答[11-13]；納米二氧化硅可以激活內質網UPR應答[14]。但針對非金屬納米材料對UPR應答的誘導研究還很少。

鈣穩態的失衡、膜泡轉運受損、蛋白降解和氧化應激均能誘導線粒體UPR(UPRmt)和內質網UPR(UPRER)[15-16]。本研究利用秀麗線蟲作為在體模型，旨在探討GO暴露對機體氧化損傷及UPR應答的激活，并通過抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)的保護作用分析GO誘導的UPR應答與氧化應激的關系。秀麗線蟲(C.elegans)是一種在發育、遺傳等研究領域廣泛應用的模式動物[17]，具有繁殖周期短(2～3 d)、繁殖力高(一只秀麗線蟲可產生約200～300條后代)、周身透明便于觀察、易于培養且成本低廉、遺傳背景清楚等眾多優良特性。C.elegans中存在的抗氧化酶與人體的抗氧化酶十分相似，主要是超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)。另外，C.elegans體內還含有谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和過氧化物酶基因(PRDX)等[18]，C.elegans的抗氧化功能檢測對研究人體抗氧化功能有著重要意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

野生型秀麗線蟲N2、指示內質網未折疊蛋白反應SJ4005(zcIs4[hsp-4::GFP])、線粒體未折疊蛋白反應SJ4100(zcIs13[hsp-6::GFP])轉基因秀麗線蟲和尿嘧啶缺陷型大腸桿菌E.coliOP50由美國CaenorhabditisGenetics Center(CGC)提供。

GO按照文獻方法制備[19]。BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術研究所提供， SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 秀麗線蟲培養

野生型和突變體秀麗線蟲培養于秀麗線蟲生長培養基(NGM)，待大量線蟲處于產卵期時以M9洗下，置于1.5 mL離心管中，M9溶液中含22 mmol·L-1KH2PO4、33.71 mmol·L-1Na2HPO4、85.56 mmol·L-1NaCl和1 mmol·L-1MgSO4，清洗2～3次以去除蟲體表面的食物；加入裂解液(0.45 mol·L-1NaOH，質量分數為2%的NaClO)，待蟲體完全裂解后離心去除裂解液，M9清洗2～3次去除殘留的裂解液。離心搜集卵置于無食物的K buffer(53 mmol·L-1NaCl和32 mmol·L-1KCl)中20 ℃培養12～18 h，即可獲得大量處于L1時期的幼蟲，L1幼蟲經過30 h即可發育到L4時期。

1.2.2 GO暴露實驗

用K-buffer配制不同濃度的GO溶液，使用前混合均勻。采用野生型秀麗線蟲L4幼蟲暴露24 h的急性暴露方法。L4幼蟲置于含有OP50的3.5 cm NGM培養皿上，每皿加200L暴露液，輕輕旋轉搖晃，使GO均勻分布于NGM表面。暴露結束后收集蟲體，提取秀麗線蟲蛋白并立即進行酶活性的分析。

1.2.3 GO對秀麗線蟲氧化應激水平的影響

LDH是一種穩定存在于細胞質內的糖酵解酶。一般情況下，LDH穩定存在于細胞質內部，但當細胞受到刺激，LDH根據細胞膜受損情況而釋放出不同的量，進入到細胞培養液中，通過檢測培養液和細胞內LDH含量，計算出LDH釋放率而推斷細胞的受損程度。

線蟲體內丙二醛(MDA)含量的測定：L4秀麗線蟲暴露24 h后以M9洗下，在冰浴條件下勻漿，1 000 r·min-1，離心20 min，取上清液(每組3個平行樣)，按試劑盒說明測定總蛋白含量和MDA含量。

ROS檢測：采用5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (CM-H2DCFDA)檢測秀麗線蟲體內的氧自由基含量。ROS水平檢測時，將受試秀麗線蟲轉移到含有1 μmol·mL-1CM-H2DCFDA的M9緩沖液中20 ℃孵育3 h，然后轉移到2%瓊脂平面上，利用激光掃描共聚焦顯微鏡于488 nm激發波長和510 nm發射過濾器激發秀麗線蟲產生熒光并照相記錄。用Image J軟件對所激發的熒光強度進行半定量分析，以熒光的強弱反映ROS水平(RFU)。每個處理50只線蟲，每個實驗3次重復。

1.2.4 GO對秀麗線蟲抗氧化酶的影響

GO暴露后秀麗線蟲體內CAT、SOD和GSH-Px的檢測均依照南京建成生物研究所提供的試劑盒進行。

GO暴露后秀麗線蟲體內SOD酶活性的變化同時采用CF1553 [muIs84[pAD76(sod-3::GFP)]]轉基因線蟲檢測GO暴露后秀麗線蟲體內SOD-3的實時表達水平。sod-3::GFP轉基因線蟲同步化，L4幼蟲暴露于GO，24 h后置于2%凝膠墊上于熒光顯微鏡下觀察熒光強度變化，實時反映SOD-3表達水平。

1.2.5 GO對秀麗線蟲UPR的激活

hsp-4和hsp-6轉錄表達水平：野生型秀麗線蟲暴露于GO，同時以K buffer為對照，暴露結束后以K buffer洗下秀麗線蟲，Trizol法提取總RNA，用逆轉錄試劑盒進行RNA純化和cDNA合成，用SYBR Green PCR試劑盒進行實時定量分析，以act-1為內參進行均一化，△△Ct計算hsp-4和hsp-6基因的相對表達水平。

HSP-4和HSP-6蛋白水平檢測：SJ4005(zcIs4[hsp-4::GFP] V)和SJ4100(zcIs13[hsp-6::GFP])轉基因線蟲同步化，L4幼蟲暴露于GO，24 h后轉移到2%瓊脂糖凝膠墊上，熒光顯微鏡下觀察熒光強度變化，用Image J軟件對所激發的熒光強度進行半定量分析，以相對熒光單位(RFU)表示。

1.2.6 GSH的保護作用

將同步化后的卵放置在含有5 mmol·L-1GSH的NGM培養基上孵化，直至L4時期[20]。

1.3 數據統計與分析

2 結果(Results)

2.1 GO對秀麗線蟲機體氧化應激水平的影響

如圖1所示，GO短期暴露可以引起秀麗線蟲體內氧化應激水平上升，機體各種氧化指標呈上升趨勢。隨著GO暴露濃度的增加，秀麗線蟲體內ROS的積累逐漸增加(圖1a、b)。秀麗線蟲體內MDA含量也隨著GO濃度的增加而逐漸增加，10 mg·L-1GO暴露24 h就可導致秀麗線蟲MDA含量升高(圖1b)。同樣，GO暴露秀麗線蟲體內LDH含量也隨著GO暴露濃度的增加而逐漸上升，呈劑量依賴性(圖1c)。

2.2 GO對秀麗線蟲機體抗氧化酶活性的影響

隨著機體氧化應激水平上升，SOD、GSH-Px等清除自由基和抗氧化的酶活性也隨之增加，以維持機體的氧化-抗氧化狀態處于一個新的平衡，但當GO濃度達到500 mg·L-1時，SOD、CAT和GSH-Px活性不再增加，SOD和GSH-Px活性甚至有所下降(圖2)。

進一步選擇sod-3::GFP轉基因秀麗線蟲以100 mg·L-1GO進行短期暴露，結果顯示GO處理24 h可以顯著增加秀麗線蟲體內SOD-3表達水平，尤其是腸道部位SOD-3表達水平(圖3)。

圖1 氧化石墨烯(GO)對秀麗線蟲機體氧化應激水平的影響注：a和b為GO對秀麗線蟲活性氧簇(ROS)的誘導。*、**與對照相比有統計學意義，P<0.05、P<0.01。Fig. 1 Effects of graphene oxide (GO) exposure on intestinal oxidative stress of C. elegans Note: a and b show the intestinal production of reactive oxygen species (ROS) after GO exposure. * P<0.05 vs. control; ** P<0.01 vs. control.

圖2 GO對秀麗線蟲機體抗氧化酶活性的影響注：*、**與對照相比有統計學意義，P<0.05、P<0.01。Fig. 2 Effects of GO exposure on the antioxidant enzyme levels in C. elegans Note: * P<0.05 vs. control; ** P<0.01 vs. control.

圖3 GO對秀麗線蟲SOD-3表達水平的影響注：**與對照相比有統計學意義，P<0.01。Fig. 3 Effects of GO exposure on the expression of SOD-3 in C. elegans Note: ** P<0.01 vs. control.

2.3 GO誘導秀麗線蟲未折疊蛋白反應

qRT-PCR結果顯示，100 mg·L-1GO暴露后秀麗線蟲UPRER和UPRmt的指示基因hsp-4和hsp-6的表達水平均較對照有明顯升高(圖4a)。進一步以100 mg·L-1GO暴露內質網UPR(hsp-4作為報告基因)和線粒體UPR(hsp-6作為報告基因)的轉基因秀麗線蟲，暴露結束后熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，GO暴露后，hsp-4::GFP和hsp-6:GFP秀麗線蟲體內的熒光水平明顯增強，說明GO可以誘導秀麗線蟲UPRER和UPRmt應答(圖4b)。

為進一步探討GO誘導的UPR反應與氧化應激的關系，我們采用GSH進行抗氧化保護，然后檢測秀麗線蟲對GO誘導的UPR反應。結果顯示，以GSH預處理秀麗線蟲可以明顯降低秀麗線蟲UPRER和UPRmt應答代表基因hsp-4和hsp-6轉錄水平和蛋白水平的表達(見圖4)，暗示著降低氧化應激可以部分抑制UPR反應。

3 討論(Discussion)

正常條件下，機體的氧化還原體系保持動態平衡，而外源化學物的刺激可以打破機體的這種平衡，使機體處于氧化應激狀態。本研究顯示GO短期暴露可以引起秀麗線蟲體內氧化應激水平上升，ROS水平、MDA含量和LDH含量隨著GO濃度的增加而上升(圖1)。相應的，為保持機體的氧化-抗氧化體系的動態平衡、清除機體過多的自由基，秀麗線蟲體內的抗氧化酶類也隨之上升。在GO濃度低于100 mg·L-1時，秀麗線蟲體內的SOD、GSH-Px等清除自由基和抗氧化的酶活性也隨GO濃度的增加而升高，機體的氧化-抗氧化狀態處于一個新的平衡(圖2)。但當GO的濃度達到500 mg·L-1時，SOD和GSH-Px活性不再增加反而有所下降，可能是由于高劑量GO所致的氧化應激超出了機體抗氧化的清除能力，增加了抗氧化酶的消耗，氧化-抗氧化的平衡被打破(圖2)。

在氧化應激狀態下，自由基、ROS等在機體內累積，攻擊蛋白質、DNA等生物大分子使其結構被破壞，造成細胞內環境穩態的失衡，進而使呼吸系統、神經系統和心肌系統出現氧化應激反應，產生相應疾病[21-22]。內質網和線粒體是細胞內重要的細胞器：內質網是真核細胞中蛋白質合成、折疊與分泌的重要場所，線粒體調控多種細胞內信號通路。環境應激會使細胞內蛋白質合成過快以至于超過蛋白折疊能力、內質網鈣代謝紊亂等引發內質網應激[20]；大量錯誤折疊或未折疊蛋白堆積在線粒體則會造成線粒體功能紊亂[15]。未折疊蛋白反應是機體通過監督和識別未正確折疊與修飾的蛋白質，引起一系列特定的靶基因轉錄和蛋白質翻譯水平下調，從而維持細胞正常功能的一種自我保護機制[10]。hsp-4編碼哺乳動物grp78/BiP的同源物，是秀麗線蟲UPRER的指示[23]，hsp-6編碼dnak/hsp70分子伴侶超級家族成員的線粒體特異性轉錄因子受體，常作為UPRmt的指示[24]。研究結果提示，GO可以誘導秀麗線蟲UPRER和UPRmt應答，而抗氧化劑GSH的保護可以有效降低UPRER和UPRmt應答，說明GO誘導的UPR反應是與氧化應激相關的(見圖4)。Runkel等[15]發現抗氧化劑可以抑制UPRmt，潘麗等[25]發現丙烯腈(ACN)引起的大鼠肝臟氧化損傷是引起內質網應激(ERS)發生的原因之一，這與本研究結果相似。因此推測，機體在氧化應激條件下可以激活UPR應答，通過啟動UPR降低機體未能正確折疊或修飾的蛋白質，進而提高機體應對和緩解應激的能力，維持機體內環境的穩定。

圖4 GO誘導秀麗線蟲未折疊蛋白反應(UPR)及谷胱甘肽(GSH)的保護作用注：a. GO對hsp-4和hsp-6轉錄水平的影響；b. GO對HSP-4和HSP-6蛋白水平的影響。 *、**與對照相比有統計學意義，P<0.05、P<0.01。#與GO暴露組相比有統計學意義，P<0.05。Fig. 4 The unfolded protein response (UPR) induced by GO and the protection effects of glutathione (GSH) in C. elegans Note: a. transcriptional regulation of GO on hsp-4 and hsp-6; b. effects of GO on the protein levels of HSP-4 and HSP-6. * P<0.05 vs. control; ** P<0.01 vs. control; # P<0.05 vs. GO group.