PCB118對GT1-7細胞GnRH分泌及Kisspeptin/GPR54信號通路蛋白表達的影響

黃苑，蘇曉鷗，張維，齊香榮，林剛

中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全研究重點實驗室，北京 100081

多氯聯苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是一類高溫氯化合成的氯代聯苯同系物，具有持久性、半揮發性、生物蓄積性和潛在毒性等特征，同時具有內分泌干擾效應，是一類典型的環境內分泌干擾物(endocrine disruptive chemical, EDCs)。因其良好性能曾被廣泛生產和使用，到20世紀80年代左右停產[1]，但PCBs至今仍廣泛存在于大氣、飄塵、水體和土壤中[2-4]，并在水陸生動物包括高等哺乳動物體內檢出，甚至在人體脂肪組織、母乳和血清中亦有檢出[5-8]。PCBs分為類二噁英多氯聯苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls, DL-PCBs)和非類二噁英多氯聯苯(non-dioxin-like polychlorinated biphenyls, NDL-PCBs)兩大類，DL-PCBs因其化學結構與二噁英相似，較NDL-PCBs具有更強的毒性作用。PCB118是12種DL-PCBs之一，Kerchich等[9]報道PCB118在垃圾焚燒后的灰分和煙霧中均有較高的暴露水平，占據DL-PCBs總量的67%；在我國東部電子垃圾拆解工人血清中，PCB118是檢出率很高的PCBs單體之一[10]。流行病學調查顯示，PCB118暴露對代謝紊亂、行為異常、內分泌干擾及生殖異常甚至癌癥等有關[11-14]。

針對PCBs內分泌干擾的已有研究主要集中于甲狀腺素和雌激素干擾效應兩大方面，對神經內分泌干擾的研究相對較少。而神經內分泌可通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonad, HPG)參與調控生殖內分泌，在機體生殖和發育過程中發揮很大的作用。GnRH神經元作為HPG軸的關鍵靶標，既參與合成和分泌促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)，又是調控哺乳動物生殖系統的最終共同通路。已有研究表明，Aroclor 1254和PCB118等PCBs混合物或單體能夠在細胞水平上干擾GnRH的合成和分泌[15-16]，但具體的信號機制尚未深入探究。因此，本研究以小鼠下丘腦永生GnRH神經元離體細胞系GT1-7細胞為模型，從細胞存活率、GnRH分泌水平和Kisspeptin/GPR54信號通路關鍵調控因子表達等方面探究PCB118對GT1-7細胞GnRH分泌的影響和作用機制，為進一步揭示PCBs發揮內分泌干擾效應的毒性機理奠定基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

小鼠下丘腦永生GnRH神經元離體細胞系GT1-7細胞株由軍事醫學科學院彭雙清研究員饋贈。細胞培養：GT1-7細胞培養于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。24 h更換一次培養液，待細胞生長融合達80%～90%后，用PBS溶液洗滌細胞2～3次，加入適量0.05%胰酶-EDTA溶液消化1 min，1 000 r·min-1離心4 min，棄去上清液，用新鮮的完全培養基重懸細胞，按照1∶3比例傳代。

1.2 實驗試劑

PCB118標準品(德國DR公司，純度為99.5%)，10 mg PCB118溶于612.34 μL二甲基亞砜(DMSO)，配制成50 mmol·L-1的母液，常溫保存備用。DMEM高糖培養基、胰蛋白酶液、青鏈霉素雙抗、RIPA蛋白裂解液、PMSF和ECL化學發光試劑盒均購自北京中科邁晨科技有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；CCK-8檢測試劑盒購自日本Dojindo公司；乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠GnRH酶聯免疫標記檢測試劑盒購自美國BIM公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國CST公司；SurePAGETM蛋白預制膠購自中國金斯瑞生物科技有限公司； G蛋白偶聯受體54(G-protein-coupled receptor 54，GPR54)一抗、磷脂酶C(phospholipase C, PLC)一抗和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)一抗購自美國Abcam公司；GnRH一抗購自美國Lifespan公司；β-actin一抗購自上海愛必信生物科技有限公司；HRP標記山羊抗鼠二抗、HRP標記山羊抗兔二抗購自北京博奧龍免疫技術有限公司。

1.3 主要儀器

1300 SERIES A2型生物安全柜(美國Thermo Scientific公司)；Synergy HTX多功能酶標儀(美國BioTek公司)；Mini-PROTEAN 4垂直電泳槽和Mini Trans-Blot Cell轉印槽(美國Bio-Rad公司)；Tanon 5200全自動化學發光成像分析系統(上海天能科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞存活率實驗

取對數期生長良好的GT1-7細胞，以每孔5×103個的密度接種于96孔細胞培養板中，置于細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)預培養24 h，每組設置6個重復。加入含不同濃度PCB118的DMEM完全培養基(0、0.05、0.5、5、50、500、5 000和50 000 nmol·L-1，DMSO≤0.1%)，設置DMSO對照組(濃度為0.1%)，繼續培養6、12、24和48 h。之后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，置于細胞培養箱繼續孵育1 h，酶標儀測定450 nm吸光度值(A450值)，設置650 nm作為參考波長，試驗至少重復3次。計算各組平均A值和細胞相對存活率，細胞相對存活率(%)=(A染毒組-A背景對照)/(A對照組-A背景對照)×100%。

1.4.2 LDH活性檢測

取生長良好的GT1-7細胞接種于96孔板中，每組設置6個重復，置于細胞培養箱預培養24 h后進行染毒處理，試驗分組包括背景空白對照孔(無細胞不完全培養基)、樣品對照孔(未經毒物處理的溶劑對照細胞孔)、樣品最大酶活性對照孔(未經毒物處理的用于后續裂解的細胞孔)和毒物處理樣品孔(不同濃度PCB118：0、50、500、5 000、50 000 nmol·L-1)；置于細胞培養箱繼續培養24 h，在檢測時間點前1 h，在樣品最大酶活對照孔中加入20 μL乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放劑，置于細胞培養箱中孵育1 h后400 g離心5 min；每孔取出120 μL上清液至新的96孔板相應孔中；按照說明書現配LDH檢測工作液，每孔加入60 μL工作液；室溫避光孵育30 min后測定490 nm波長處吸光度值(A490值)；將測得的各組吸光度減去背景空白對照孔吸光度后計算LDH活力(%)，LDH活力(%)=(A處理樣品-A樣品對照)/(A細胞最大酶活性對照-A樣品對照)×100%。

1.4.3 GnRH分泌量檢測

將GT1-7細胞接種于6孔板中，預培養24 h后使用無血清的不完全培養基饑餓處理12 h，更換含有不同濃度PCB118的完全培養基(0、0.05、5、500和50 000 nmol·L-1)處理細胞6 h和24 h，收集細胞培養上清液用于GnRH分泌量測定，細胞用于Kisspeptin/GPR54信號通路分析。應用小鼠GnRH酶聯免疫標記檢測試劑盒檢測GT1-7細胞培養上清液中GnRH分泌量。酶標儀測定450 nm處吸光度值，根據標準品繪制的GnRH標準曲線計算樣品GnRH濃度。

1.4.4 Western Blot

細胞接板和染毒同1.4.3。吸除細胞培養上清液后，用預冷的PBS洗滌細胞，加入細胞裂解液裂解60 min，收集細胞裂解物，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min，點樣并進行凝膠電泳。電泳結束后將分離的蛋白條帶轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃一抗孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入ECL化學發光顯色液，利用全自動化學發光凝膠成像系統拍照并分析條帶的灰度值(IDV值)，計算IDV目的蛋白/IDV內參蛋白值，獲得目的蛋白的相對表達量。

1.5 數據統計分析

2 結果(Results)

2.1 PCB118對GT1-7細胞增殖的影響

不同濃度PCB118作用GT1-7細胞6、12、24和48 h后，細胞存活率的變化結果如圖1所示。從劑量效應上看，處理6 h，PCB118對GT1-7細胞的存活率無顯著影響；處理12 h和48 h，隨PCB118作用濃度增加(0.05～50 000 nmol·L-1)，各濃度組與對照組相比均能顯著降低細胞存活率(P<0.05或P<0.01)；處理24 h，隨PCB118作用濃度增加(0.5～50 000 nmol·L-1)，各濃度組均能顯著降低細胞存活率(P<0.05或P<0.01)。從時間效應上看，處理12 h，0.5～50 000 nmol·L-1劑量組中細胞存活率顯著(P<0.05或P<0.01)低于6 h；處理24 h，0.05～50 000 nmol·L-1劑量組中細胞存活率顯著(P<0.05或P<0.01)低于6 h；處理48 h，各劑量組細胞存活率與6 h時細胞存活率相比較均表現出顯著(P<0.01)差異性。結果表明，隨著作用時間延長，PCB118以劑量依賴性方式顯著降低GT1-7細胞存活率，呈現一定的劑量效應和時間效應。

圖1 PCB118對GT1-7細胞存活率的影響注：細胞存活率表示為3次獨立試驗的平均值±標準差(n=6)；* P<0.05、** P<0.01表示與同時間點 對照組相比差異顯著；^ P<0.05、^^ P<0.01表示與6 h相比差異顯著。Fig. 1 Effects of PCB118 on cell viability of GT1-7 cells Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group; ^ P<0.05, ^^ P<0.01, compared to the 6 h group.

2.2 PCB118對GT1-7細胞LDH釋放的影響

不同濃度PCB118(50、500、5 000和50 000 nmol·L-1)處理GT1-7細胞24 h后，各濃度組培養基上清液中LDH活力分別為陽性對照組(最大酶活性對照孔)的4.23%±0.91%、3.97%±0.78%、3.77%±0.67%和15.52%±1.56%。50、500和5 000 nmol·L-1PCB118未造成細胞培養基上清液中的LDH釋放量增加，50 000 nmol·L-1PCB118能夠顯著促進LDH的釋放(P<0.01)，結果如圖2所示。這說明只有高濃度PCB118才會引起細胞膜通透性的增加，具有明顯的細胞毒性作用。

2.3 PCB118對GT1-7細胞GnRH分泌的影響

將不同濃度PCB118(0、0.05、5、500和50 000 nmol·L-1)對GT1-7細胞分別染毒6 h和24 h，ELISA法檢測細胞培養液內GnRH濃度，并用細胞內總蛋白含量進行標準化，結果如圖3所示。PCB118染毒6 h后，5和500 nmol·L-12個濃度組細胞培養液中GnRH的含量顯著低于對照組(P<0.05)，50 000 nmol·L-1濃度組細胞培養液中GnRH的含量顯著低于對照組(P<0.01)；PCB118染毒24 h后，0.05和5 nmol·L-1濃度組GnRH的變化無明顯統計學差異，500和 50 000 nmol·L-1濃度組細胞培養液中GnRH的含量顯著低于對照組(P<0.05)。

圖2 PCB118對GT1-7細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放的影響注：數值為處理組細胞LDH釋放量相對于陽性對照組的比值， 以3次獨立試驗的平均值±標準差表示(n=6)； 與對照組相比，*P<0.05、** P<0.01。Fig. 2 Effects of PCB118 treatment on the release of lactate dehydrogenase (LDH) from GT1-7 cells Note: Date represented the LDH leakage content of the treatment group relative to the positive control group, and were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. *P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group.

圖3 PCB118對GT1-7細胞GnRH分泌的影響注：用細胞內總蛋白含量標準化細胞培養液中GnRH含量，數據表示3次獨立試驗的平均值±標準差(n=3)；與對照組相比，*P<0.05、** P<0.01。Fig. 3 Effects of PCB118 treatment on GnRH secretion in GT1-7 cells Note: Date were described as the concentration of GnRH in cell culture medium relative to the total proteins in GT1-7 cells, and expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, **P<0.01, compared to the control group.

圖4 PCB118染毒6 h和24 h后Kisspeptin/GPR54信號通路蛋白的表達情況Fig. 4 The expression of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT1-7 cells treated with PCB118 for 6 h and 24 h

2.4 PCB118對Kisspeptin/GPR54信號通路的影響

PCB118分別對GT1-7細胞染毒6 h和24 h，提取胞內總蛋白并定量，用Western Blot法分析Kisspeptin/GPR54信號通路上關鍵蛋白的表達情況，應用Image J軟件對結果進行定量分析。結果如圖4和圖5所示，PCB118染毒GT1-7細胞6 h后，0.05 nmol·L-1PCB118對蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC的表達無顯著影響；5、500和50 000 nmol·L-1PCB118均能顯著降低蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC表達水平(P<0.01或P<0.05)。染毒24 h后，500和50 000 nmol·L-1PCB118均能顯著降低蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC表達水平(P<0.01或P<0.05)。

3 討論(Discussion)

本研究主要圍繞PCB118對GT1-7細胞的增殖毒性作用和GnRH分泌水平的影響及其機制，分析了PCB118對GT1-7細胞的細胞存活率、GnRH分泌以及Kisspeptin/GPR54信號通路在PCB118干擾GT1-7細胞分泌GnRH中的作用，以期闡明PCB118的神經內分泌干擾效應及潛在機制。研究發現，PCB118對GT1-7細胞具有一定的細胞增殖毒性并能抑制GT1-7細胞分泌GnRH，下調GnRH、GPR54、PLC和PKC等關鍵蛋白表達水平，表明Kisspeptin/GPR54信號通路可能介導了PCB118干擾GT1-7細胞GnRH的分泌。

圖5 PCB118染毒6 h和24 h后Kisspeptin/GPR54信號通路相關蛋白的定量分析注：數據表示3次獨立試驗的平均值±標準差(n=3)；與對照組相比，* P<0.05、** P<0.01。Fig. 5 Quantitative analysis of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT1-7 cells treated with PCB118 for 6 h and 24 h Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group.

CCK-8實驗結果表明，PCB118具有抑制GT1-7細胞增殖的作用，隨PCB118暴露劑量(0.05～50 000 nmol·L-1)的增加，細胞存活率逐漸降低，呈現明顯的劑量效應關系；隨PCB118暴露時間(6～48 h)的延長，細胞存活率呈現下降趨勢，并呈現一定的時間效應，。Dickerson等[15]已研究發現PCB118(0.1～100 μmol·L-1)體外暴露GT1-7細胞24 h內能夠抑制細胞增殖，而本研究發現更低濃度PCB118仍然具有抑制GT1-7細胞增殖的作用。Hashmi等[17]也發現PCB118(1～20 μg·mL-1)作用人胚肺成纖維細胞12～48 h后具有顯著抑制細胞增殖的作用。但Yang等[13]發現，低濃度PCB118(0.025～25 nmol·L-1)并未顯著抑制大鼠甲狀腺細胞增殖，只在250～25 000 nmol·L-1濃度范圍內表現出顯著性抑制作用。這提示PCB118具有抑制細胞增殖的作用，但不同類型細胞對PCB118敏感度存在差異，神經細胞可能對PCB118更加敏感。LDH釋放實驗結果顯示，只有50 000 nmol·L-1PCB118對細胞膜產生明顯的損傷，從而顯著促進LDH釋放。雖然低濃度組并未與對照體現出顯著性差異，但CCK-8實驗結果表明，低濃度PCB118具有一定的細胞增殖毒性，因而其低劑量毒性效應仍不容忽視。根據上述結果并結合PCB118在環境介質和動物機體中的暴露水平[9,18]，選擇0.05、5、500和50 000 nmol·L-1的低中高濃度作為研究PCB118干擾GT1-7細胞GnRH分泌的濃度。

GnRH由下丘腦神經元合成并分泌，經垂體門脈系統調節腺垂體的促性腺激素分泌，進而調控性腺激素水平和生殖功能[19]。目前，已有研究表明PCBs可以干擾神經內分泌系統，影響大鼠腦組織中GnRH表達，進而影響機體性別分化，造成生殖功能紊亂[20]；Khan等[21]也發現多氯聯苯混合物Aroclor 1254(主要成分是PCB118)能損傷魚類下丘腦前部中GnRH的合成和釋放。本研究發現，不同濃度PCB118處理GT1-7細胞不同時間對GnRH分泌具有不同程度的抑制作用。處理6 h，5、500和50 000 nmol·L-1PCB118能顯著抑制GT1-7細胞GnRH的分泌，這與Dickerson等[15]發現的PCB118(0.1～10 μmol·L-1)作用GT1-7細胞4 h促進GnRH分泌的結果不一致，可能與實驗中細胞狀態、藥物干預濃度和GnRH脈沖分泌時間有關。細胞培養上清液中GnRH由具有活性的GT1-7細胞分泌，PCB118對GT1-7細胞增殖的抑制作用可能是造成GnRH分泌量降低的原因之一。但作用6 h時，PCB118并未顯著抑制細胞增殖，因此短時間內GnRH分泌量的改變可能并不是由細胞增殖的變化引起的。處理GT1-7細胞24 h，高濃度PCB118能顯著抑制GT1-7細胞分泌GnRH，這與Dickerson等[15]發現的PCB118(1～100 μmol·L-1)作用GT1-7細胞24 h顯著抑制GnRH分泌的結果一致。這種抑制作用一方面是由于PCB118干擾GT1-7細胞增殖，另一方面可能是PCB118間接干擾了某些調節GnRH功能的神經遞質信號通路。

GnRH的合成和分泌過程受到諸多因子調控，其中，Kisspeptin/GPR54信號通路是參與GnRH脈沖式分泌的關鍵信號機制。GnRH神經元受到其上游神經元(kiss-1)的直接調控，kiss-1神經元內的kiss-1基因可以編碼Kisspeptin多肽，Kisspeptin通過與其受體GPR54[22]結合激活PLC反應途徑，從而激活下游激酶如PKC等磷酸化級聯反應途徑，并活化細胞膜上非選擇性陽離子通道以及抑制K+的外向電流，達到GnRH神經元的去極化，從而參與調控GnRH的合成和分泌[23-25]。GPR54、PLC和PKC等均是Kisspeptin/GPR54信號通路中的關鍵調控蛋白。已有研究表明，在GT1-7細胞中，Kisspeptin/GPR54可通過PKC信號通路調節下游細胞內鈣離子通量從而影響GnRH的分泌[26]。因此，本研究初步分析了PCB118對Kisspeptin/GPR54信號通路中關鍵蛋白表達水平的影響。結果表明，Kisspeptin/GPR54信號通路上關鍵蛋白的變化趨勢與PCB118影響GT1-7細胞分泌GnRH的變化趨勢基本一致，PCB118顯著下調GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白的表達，并呈現一定的劑量依賴性。雖然類環境劑量組中0.05 nmol·L-1PCB118對GnRH分泌量和GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白的表達均無顯著影響，但5 nmol·L-1PCB118作用6 h，在不影響細胞增殖的情況下即可抑制GT1-7細胞GnRH的合成和分泌，并顯著下調Kisspeptin/GPR54信號通路上GPR54、PLC和PKC等蛋白的表達，這表明環境劑量下PCB118仍然具有一定的內分泌干擾效應。值得注意的是，5 nmol·L-1作用24 h時，PCB118對GT1-7細胞的GnRH分泌和相關蛋白的表達影響并不顯著，推測可能存在其他調控機制。已有研究表明，細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase)ERK和cAMP/PKA信號通路參與Kisspeptin刺激GT1-7細胞GnRH受體的表達[27]，該信號通路是否參與PCB118對GT1-7細胞GnRH分泌的影響仍需進一步研究。500 nmol·L-1PCB118作用6 h和24 h后，均能顯著抑制GnRH分泌和蛋白的表達，雖然該濃度稍高于正常的環境水平，但在長期生活于受PCBs污染的地區或接觸電子垃圾的動物或人體內屬于正常水平，因而其所帶來的危害不容忽視。50 000 nmol·L-1PCB118遠高于環境介質中的水平，在設定的時間范圍內，能穩定地抑制GnRH分泌并下調Kisspeptin/GPR54信號通路中相關蛋白的表達水平。由此說明，PCB118可通過干擾Kisspeptin/GPR54信號通路中相關蛋白的表達而發揮神經內分泌干擾作用。

本研究表明，PCB118在環境劑量下，仍然對GT1-7細胞具有一定的細胞增殖毒性和GnRH分泌的干擾效應，在抑制GnRH分泌的同時能夠下調Kisspeptin/GPR54信號通路關鍵蛋白的表達，提示該信號通路可能參與了PCB118影響GT1-7細胞GnRH的分泌。Dickerson等[15]已經發現雌激素受體(estrogen receptor, ER)抑制劑可以拮抗PCB118對GT1-7細胞GnRH分泌的抑制作用，提示PCB118可通過ER途徑干擾GnRH分泌。本試驗提供了PCB118干擾GT1-7細胞GnRH分泌的另一潛在分子機制，但是Kisspeptin/GPR54信號通路在介導PCB118發揮神經內分泌干擾效應中的具體作用機制，以及其他信號通路的介入情況，仍需要進一步深入研究。