三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯對大鼠的神經毒性效應

王思敏，李學彥，周啟星,*，胡獻剛，邵曉東，張永國

1. 南開大學環境科學與工程學院，環境污染過程與基準教育部重點實驗室/天津市城市生態環境修復與污染防治重點實驗室，天津 300350 2. 沈陽軍區總醫院消化科，沈陽 110016

近年來，隨著溴化阻燃劑(BFR)的逐步淘汰，有機磷系阻燃劑(OPFRs)的生產和應用越來越多[1]。其中，三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯(TDCPP)已被用作溴化阻燃劑的主要替代品添加到各種產品中，如電子設備、家具、紡織品、泡沫、車內飾件和兒童玩具等[2-3]。由于TDCPP主要以摻雜混合而非化學鍵合方式加入到材料中，所以很容易釋放到環境中[3]，已經在室內空氣[4]、房屋灰塵[5]、飲用水[6]、沉積物[7]和生物組織中檢測到了有機磷阻燃劑TDCPP[8-9]。有研究表明，TDCPP具有潛在的致癌性[10-11]；能夠顯著性改變斑馬魚肝臟組織中的炎癥反應相關基因的表達[12-13]；當禽類胚胎暴露于TDCPP后，肝臟的多種與物質代謝和免疫應答相關基因的表達改變[14]。還有一些研究認為，有機磷阻燃劑可以通過類固醇生成或雌激素代謝而改變性激素的平衡[15]。TDCPP與有機磷農藥結構相似，已經有研究證明，TDCPP等有機磷阻燃劑會對生物的神經系統發育產生不良影響[16-18]；具有潛在的神經毒性和發育毒性[19-21]。有研究發現，PC12細胞在暴露于不同濃度的TDCPP和磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)后，顯微鏡下觀察到細胞形態發生改變，同時PC12細胞存活率降低，并存在劑量-效應關系[22]；有機磷阻燃劑對神經細胞也具有毒性作用，能夠引起神經細胞的氧化損傷和細胞周期阻滯[23]。也有研究表明，TDCPP能夠引起成年雌魚大腦中多巴胺及血清素水平的降低，在雄魚和雌魚大腦中均發現神經系統發育基因的下調[24]。

但是，在TDCPP神經毒性研究方面，現有研究大多集中在體外實驗和魚類，

對哺乳動物研究資料相對缺乏。因此，本研究主要觀察TDCPP對大鼠神經系統的毒性效應及其程度，并探討TDCPP暴露后導致神經毒性的機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料與儀器

SPF級SD大鼠購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司；TDCPP(>95%，Tokyo Chemical Industry，日本)，乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、多巴胺(DA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，特級初榨橄欖油購自西班牙阿布利爾。

瑞士Tecan多功能酶標儀平臺Spark 10M，透射電鏡(H-7650，日立，日本)，Morris水迷宮(SLY-WMS，北京碩林苑科技公司，中國)，離心機(5804 R, Eppendorf, 德國)，切片機(EM UC7, Leica, 德國)，包埋機(EG1150H, Leica, 德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒溶液配制

TDCPP以橄欖油為溶劑，染毒組的暴露劑量分別為TDCPP半致死劑量的1/16、1/8和1/4，即125、250、和500 mg·kg-1·d-1，通過灌胃的方式給藥，每日給藥一次。

1.2.2 實驗動物及分組

6～8周SPF級雄性SD大鼠60只，實驗動物飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所，每天12 h/12 h白晝/黑夜燈光交替照射，控制室內溫度為22～24 ℃，濕度40%～60%。實驗動物自由飲水及進食。

60只雄性大鼠隨機分為5組，每組12只：空白組(Control)，不做任何處理；溶劑對照組(Solvent)，每天以相同體積的橄欖油灌胃；低劑量組，灌胃劑量為125 mg·kg-1·d-1；中劑量組，灌胃劑量為250 mg·kg-1·d-1；高劑量組，灌胃劑量為500 mg·kg-1·d-1。于第12周末進行Morris水迷宮實驗，包括定位航行實驗和空間探索實驗。行為學實驗結束后，禁食12 h，以0.3 mL·(100 g)-1劑量注射10%水合氯醛麻醉，取出腦組織，用生理鹽水沖洗干凈，并分離出紋狀體固定在戊二醛中，一部分凍存在-80 ℃冰箱待檢。

1.2.3 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮分析系統主要由攝像頭、電腦、水池和站臺組成。水池直徑為160 cm，高度為60 cm，內壁被漆為黑色，池壁內貼有形狀不同的標記物。水池分為4個象限，第1象限內距離池壁20 cm處放置一個直徑為12 cm的黑色圓形站臺。大鼠在進行游泳實驗時水溫保持在(24±2) ℃，平臺位于水面下1 cm。

定位航行實驗：行為學實驗的前4天為定位航行實驗，將大鼠分別從4個不同象限面壁放入水池中，記錄大鼠在60 s內找到站臺的時間，即為逃避潛伏期。若超過60 s未能找到平臺，則引導其找到站臺適應15 s逃逸時間記錄為60 s。

空間探索實驗：行為學實驗第5天撤去站臺，將大鼠從第3象限面壁置入池內，記錄大鼠在60 s內在目標象限停留時間和運動距離百分比。

1.2.4 生化指標檢測

紋狀體DA、TNF-α和IL-1β的水平使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測，紋狀體中的AChE、腦組織中SOD和GSH使用試劑盒測定。

取紋狀體，用2.5%的戊二醛溶液在4 ℃的條件下固定超過24 h。用磷酸緩沖液漂洗樣品，用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h，再次漂洗，脫水處理，包埋劑包埋，切片機切片，獲得70～90 nm的切片。切片先經檸檬酸鉛溶液染色，再用醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色5～10 min，在透射電鏡中觀察紋狀體超微結構。

1.3 統計學分析

采用SPSS21.0和ORIGIN進行數據分析，大鼠的體重和水迷宮數據采用重復測量數據的方差分析，其余各項指標采用單因素方差分析，當P<0.05時，認為差異在統計學上具有顯著性。除行為學實驗每組樣本為9例，其余各項實驗每組樣本均為5例。

2 結果(Results)

2.1 大鼠一般體征

實驗結果顯示，12周給藥期間，TDCPP染毒組的大鼠均表現為皮毛缺少光澤等不良狀態，其中高劑量染毒組大鼠死亡1只。大鼠每周體重變化見表1。實驗期間，空白對照組、溶劑對照組、低劑量染毒組和中劑量染毒組的體重隨著時間變化均呈現上升趨勢，其中，空白對照組和溶劑對照組的體重上升幅度最大，高劑量染毒組的體重在0到8周期間呈現出緩慢上升的趨勢，8周后體重開始下降。12周體重數據顯示，空白對照組的體重與溶劑對照組相比無明顯差異，對照組與TDCPP染毒組的差別具有統計學意義，對照組的體重高于TDCPP染毒組的體重且具有劑量依賴性，即隨著染毒劑量的升高，大鼠體重下降更加明顯。在第12周周末，中劑量和高劑量組大鼠體重與對照組相比顯著降低(*P<0.05，**P<0.01)。染毒組間體重比較結果顯示，與低劑量組(##P<0.01)和中劑量組(△△P<0.01)相比，高劑量組體重顯著性降低。

2.2 Morris水迷宮

2.2.1 定位航行實驗

定位航行實驗結果顯示(表2)，行為學實驗期間，每組大鼠的逃避潛伏期均呈現逐漸下降的趨勢，表明各組大鼠均具有一定的空間學習記憶能力，其中，空白對照組和溶劑對照組逃避潛伏期下降得最快，且兩者行為學實驗結果相比，無顯著差異(P>0.05)。從水迷宮實驗第2天的數據可以看出，染毒組的逃避潛伏期較空白對照組和溶劑對照組有延長的趨勢。實驗第3天，高劑量染毒組的逃避潛伏期顯著高于對照組，差異顯著(*P<0.05)；染毒組組間比較結果顯示，高劑量染毒組的逃避潛伏期顯著高于低劑量染毒組，差異顯著(#P<0.05)。實驗第4天結果表明，染毒組的逃避潛伏期均高于空白對照組和溶劑對照組，且隨著染毒劑量的增加而升高，其中，高劑量染毒組的逃避潛伏期顯著高于對照組(**P<0.01)，且顯著大于低劑量(##P<0.01)和中劑量染毒組(△△P<0.01)。

表1 三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯(TDCPP)暴露12周后不同處理組中大鼠的體重Table 1 The body weight of rats in different groups after tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCPP) exposure for 12 weeks

注：*、** TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組相比，P<0.05、P<0.01；#、##高劑量染毒組與低劑量染毒組相比，P<0.05、P<0.01；△△高劑量染毒組與中劑量染毒組相比，P<0.01。

Note: * statistically significant (P<0.05), ** statistically significant (P<0.01), when TDCPP treatment groups compared with blank control and solvent control group;#statistically significant (P<0.05),##statistically significant (P<0.01), when high dose group compared with low dose group;△△statistically significant (P<0.01), when high dose group compared with medium dose group.

表2 TDCPP暴露對大鼠逃避潛伏期的影響(n=9,)Table 2 Effects of TDCPP on the escape latency of rats (n=9,)

注：*、**TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組相比，P<0.05、P<0.01；#、##高劑量染毒組與低劑量染毒組相比，P<0.05、P<0.01；△△高劑量染毒組與中劑量染毒組相比，P<0.01。

Note: * statistically significant (P<0.05), **statistically significant (P<0.01), when TDCPP treatment groups compared with blank control and solvent control group;#statistically significant (P<0.05),##statistically significant (P<0.01), when high dose group compared with low dose group;△△statistically significant (P<0.01), when high dose group compared with medium dose group.

2.2.2 空間探索實驗

空間探索實驗結果如圖1所示，各染毒組大鼠在目標象限停留的時間隨著染毒劑量的增加而減少，其中，中劑量染毒組和高劑量染毒組在目標象限停留時間顯著低于對照組(*P<0.05)；染毒組之間無顯著性差異(P>0.05)。大鼠在目標象限游泳距離百分比結果各組間無顯著性差異(P>0.05)。這表明，TDCPP能對大鼠的空間學習記憶能力產生一定影響。

2.3 神經遞質多巴胺及乙酰膽堿酯酶的變化

多巴胺是哺乳動物中樞神經系統中的一種重要的神經遞質，占所有腦內兒茶酚胺類神經遞質總含量的80%，可調節大腦的多種功能[25-27]，在腦內紋狀體的含量極高，約占全腦總含量的70%[28]。本實驗在第12周取大鼠紋狀體，制作組織勻漿并檢測了紋狀體中多巴胺的含量和乙酰膽堿酯酶水平，實驗結果如圖2(a)所示，高劑量染毒組和中劑量染毒組大鼠紋狀體DA含量均低于空白對照組和溶劑對照組，但差異不具有顯著性，而低劑量TDCPP并未引起大鼠紋狀體內DA含量的明顯改變。大鼠紋狀體AChE含量檢測結果如圖2(b)所示，TDCPP各染毒組紋狀體AChE水平低于空白對照組和溶劑對照組，差異顯著(**P<0.01)，且隨著染毒劑量的升高，AChE水平下降得越為明顯；染毒組組間比較結果顯示，與低劑量染毒組相比較，高劑量染毒組AChE含量顯著性降低，差異顯著(#P<0.05)。

圖1 TDCPP暴露對大鼠在目標象限停留時間和游泳距離百分比的影響注：*TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組比較，P<0.05。Fig. 1 The duration and percentage of the swimming distance in target quadrant of rats after TDCPP exposure Note: *statistically significant (P<0.05), when TDCPP treatment groups compared with blank control and solvent control group.

圖2 TDCPP暴露對大鼠紋狀體內多巴胺和乙酰膽堿酯酶水平的影響注：**TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組比較，P<0.01；# 高劑量染毒組與低劑量染毒組比較，P<0.05。Fig. 2 The levels of dopamine and acetylcholinesterase (AchE) in rat striatum after TDCPP exposure Note: **statistically significant (P<0.01), when TDCPP treatment groups compared with blank control and solvent control group; # statistically significant (P<0.05), when high dose group compared with low dose group.

圖3 TDCPP暴露對大鼠腦組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β的影響注：*、** TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組比較，P<0.05、P<0.01；# 中劑量和高劑量染毒組與低劑量染毒組比較，P<0.05。Fig. 3 Changes in the levels of superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH), tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-1 β (IL-1β) in brain tissues of the rats after TDCPP exposure Note: * statistically significant (P<0.05), ** statistically significant (P<0.01), when TDCPP treatment groups compared with blank control and solvent control group; # statistically significant (P<0.05), when medium dose and high dose group compared with low dose group.

2.4 神經炎癥因子與氧化應激指標的變化

本研究檢測了腦組織勻漿中氧化應激指標SOD活性和GSH含量，以及神經炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平。

如圖3(a)所示，SOD活性在空白對照組和溶劑對照組之間比較，差異不顯著(P>0.05)；染毒組大鼠腦組織中SOD活性均低于空白對照組和溶劑對照組，且具有劑量依賴性，即大鼠腦組織中SOD活性隨著染毒劑量的升高而降低，其中，高劑量染毒組腦組織中SOD活性與對照組相比顯著降低(*P<0.05)；SOD活性在染毒組之間并無顯著性差異。圖3(b)結果顯示，大鼠腦組織谷胱甘肽(GSH)水平在空白對照組和溶劑對照組之間，無顯著性差異(P>0.05)，中劑量染毒組和高劑量染毒組GSH活性與對照組相比顯著降低(*P<0.05)；染毒組組間比較結果顯示，與低劑量染毒組相比，高劑量染毒組腦組織中GSH水平顯著降低(#P<0.05)。

實驗結果顯示(圖3(c)和(d))，2種神經炎癥因子在空白對照組和溶劑對照組之間比較，差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，中劑量染毒組和高劑量染毒組腦組織中TNF-α水平顯著升高(**P<0.01)；染毒組組間比較結果顯示，中劑量染毒組和高劑量染毒組腦組織中TNF-α水平均顯著性高于低劑量染毒組(#P<0.05)。高劑量染毒組腦組織中IL-1β水平顯著高于空白對照組和溶劑對照組(*P<0.05)；IL-1β水平在染毒組組間比較，無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 紋狀體超微結構觀察

透射電鏡下觀察對照組(圖4A～C)和高劑量染毒組(圖4D～F)大鼠紋狀體切片超微結構，結果如圖所示，對照組細胞結構組織正常，細胞器和細胞核均未出現損傷現象。高劑量染毒組神經元細胞的細胞質組分、細胞器及突觸超微結構均遭到破壞，出現細胞核固縮變形的現象；線粒體嵴縮短，空泡化現象嚴重；突觸前后膜增厚變模糊，突觸間隙減小甚至消失。

圖4 TDCPP暴露引起大鼠紋狀體超微結構損傷注：A, B, C為對照組；D, E, F為500 mg·kg-1·d-1 TDCPP暴露組。圖中細胞核固縮變形用→標注，線粒體空泡化用▲標注，突觸間隙用□標注。Fig. 4 The evidence of TDCPP-induced damages in rat striatum ultrastructures Note: A, B, C show the results of Control; D, E, F show the results of 500 mg·kg-1·d-1 group. The phenomenon of nuclear deformation was donated by →; mitochondria damage was donated by ▲; synaptic cleft was denoted by □.

3 討論(Discussion)

神經系統是機體內對生理功能活動的調節起主導作用的系統，神經行為的評價檢測及機制研究已成為重要的公共健康問題。行為變化是一種重要的神經毒性指標，當機體暴露于環境毒物時，常表現出行為功能上的障礙[29]。研究表明，多種有機磷酯阻燃劑對生物具有神經毒性，如TDCPP能夠引起禽類行為學異常[30]，磷酸三苯酯(TPP)暴露可影響斑馬魚神經發育相關基因的轉錄水平，并導致斑馬魚行為學改變[31]。本研究也表明，較高劑量的TDCPP能夠對大鼠的學習記憶能力和空間探索能力產生影響，使大鼠逃避潛伏期呈現上升趨勢，在目標象限停留的時間減低，但是低劑量的TDCPP暴露對大鼠的學習記憶能力無明顯的毒性作用。

多巴胺是哺乳動物中樞神經系統中的一種重要的神經遞質，可調節大腦的多種功能。作為腦內重要神經遞質之一，多巴胺在控制行為和認知功能中具有重要作用，同時，作為大腦發育過程中最早釋放的神經遞質之一，對神經元細胞的結構發育起著重要的作用[25-27]。當多巴胺在腦內調節紊亂時，可導致機體行為學的異常[32]。本實驗檢測了各組大鼠紋狀體內多巴胺的含量，結果表明，中劑量染毒組和高劑量染毒組紋狀體中DA含量均低于對照組，但低劑量TDCPP并未引起大鼠紋狀體內DA含量的明顯改變。

AChE在機體神經發育中有重要作用[33]，多種有機磷可在神經系統發育時期抑制AChE的活性，影響神經細胞的正常增值和分化，并對腦的正常功能產生影響[34-36]。本研究結果表明，TDCPP能夠引起大鼠腦組織中乙酰膽堿酯酶活性顯著性降低，且具有劑量依賴性，這提示TDCPP對大鼠神經系統的發育造成了損傷。

為了進一步檢測TDCPP對大鼠腦組織的損傷，本研究同時檢測了大鼠腦組織中氧化應激指標SOD和GSH，以及炎癥因子TNF-α和IL-1β。外源性化合物可以通過產生大量活性氧而造成對機體的損害，而機體內的抗氧化酶組成了防御過氧化系統，可清除活性氧，控制脂質過氧化水平，保護機體免受氧化損傷[37]。SOD活性和GSH含量的高低可以反映機體抗氧化能力[38]，本研究結果顯示，高劑量染毒組SOD活性顯著性低于對照組，中劑量染毒組和高劑量染毒組GSH含量顯著性低于對照組，表明中劑量和高劑量的TDCPP能夠對大鼠腦組織造成氧化損傷，但低劑量的TDCPP并未對大鼠腦組織的氧化系統造成明顯損傷。氧化應激和炎癥反應在組織損傷的發生和發展過程中均起著重要作用，機體內氧化應激產生的自由基可以增加炎癥反應，而炎癥反應中產生的自由基又可以加重氧化應激[39]。

炎癥因子TNF-α和IL-1β在組織中的含量可以反映機體炎癥水平和組織的損傷程度[40]。本研究發現，中劑量染毒組和高劑量染毒組大鼠腦組織中TNF-α水平與對照相比顯著性升高，高劑量染毒組腦組織中IL-1β水平與對照組相比顯著性升高；但低劑量TDCPP并未引起大鼠腦組織內炎癥因子含量的明顯改變。實驗結果提示，TDCPP能夠誘導大鼠腦組織內產生大量的活性氧，進而引起組織中的氧化應激和炎癥反應，且具有劑量依賴效應。

紋狀體切片電鏡超微結構觀察結果表明，TDCPP可引起大鼠紋狀體細胞損傷，主要表現為核固縮、線粒體損傷和突觸間隙變小等。這表明，TDCPP可導致紋狀體細胞受到損傷。

目前環境中檢測到的TDCPP主要有4個來源，室內空氣(0.11～150 ng·m-3)[4-5]、地表水(0.7～50 ng·L-1)[41-43]、沉積物(250～8 800g·kg-1)和室內灰塵(0.20～67 mg·kg-1)[1]。人群接觸到的TDCPP的劑量會因地區和環境等因素不同而不同，上述數據表明，人群能夠接觸到的TDCPP劑量介于本實驗的染毒范圍內。本實驗依據TDCPP對大鼠的口服毒性(LD50≈2 000 mg·kg-1)，染毒劑量由低到高依次為LD50的1/16、1/8和1/4。然而，本研究是一項亞慢性毒性實驗，對大鼠的暴露劑量較高，不同劑量組間跨度較大，暴露周期較短，由于TDCPP的產量和使用量呈遞增趨勢，且在環境中被高頻率檢出，進一步研究評價TDCPP對哺乳動物的慢性潛在毒性作用需要更低的暴露濃度和更長的暴露時間。

綜上所述，TDCPP可引起大鼠體重明顯下降，導致大鼠神經細胞損傷，行為改變；抑制AChE、SOD活性及GSH含量，使炎癥介質增高，引起大鼠腦組織的氧化損傷和炎癥反應。TDCPP對神經系統的毒性作用可能與其抑制膽堿酯酶活性，引起腦組織抗氧化系統損傷，導致炎癥反應的發生等一系列因素有關。