咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚聯合毒性效應

李健，吳聲敢，趙慧宇，楊桂玲

農業部農產品質量安全風險評估實驗室(杭州) 浙江省農業科學院 農產品質量與標準研究所，杭州 310021

咪鮮胺(prochloraz)是一種廣譜咪唑類殺菌劑，能夠防治子囊菌和半知菌在作物上引起的病害，對大田作物、水果、蔬菜、草皮及觀賞植物上的多種病害具有治療和鏟除作用[1]。1998年至2006年，全國20個省、市76家企業登記產品95個廠次[1]。2008年，我國咪鮮胺原藥產量達到6 000余t[2]。隨著其大量使用，在水稻[3]、黃瓜[4]等多種作物和土壤中被檢出。土壤中殘留的咪鮮胺可以隨著雨水淋溶作用等進入地表水，可能會對水生生物的生長、發育以及群落穩定等造成不利影響。

多菌靈(carbendazim)是美國杜邦公司開發的殺菌劑苯菌靈的中間產物。20世紀70年代中期，中國、德國先后實現多菌靈的工業化生產，到20世紀80年代，多菌靈已發展成為我國工業化產量最大的內吸性殺菌劑品種之一[5]。統計至2016年12月底，我國29個省、區、市686家企業登記多菌靈農藥產品929個(原藥20個，單劑253個，復配制劑656個)。從登記作物來看，多菌靈大多數登記在谷物、果蔬等30多種可食用作物上，少量登記在綠萍、觀賞類花卉、橡膠樹和棉花等非食用作物上。在美國、歐盟和澳大利亞等國家和組織，除了少量園林植物，多菌靈已退出在食用農作物上的登記[5]。2003年，英國抽查的252份梨樣品中，發現12%的樣品含有多菌靈殘留[6]，在我國許多農作物中也普遍檢測到多菌靈[7-8]。有研究表明，多菌靈在土壤中的半衰期為6～12個月[6]，土壤中殘留的多菌靈會隨著雨水淋溶作用進入地表水，加上其光穩定性強，可能會對水生生物造成潛在的威脅。

在實際生產中，咪鮮胺可與大多數殺菌劑混合或復配使用[9]，其中咪鮮胺和多菌靈復配使用較為普遍。李銳等[10]的研究表明25%咪鮮胺·多菌靈可濕性粉劑對芒果炭疽病防治效果優于單獨使用咪鮮胺和多菌靈。王良吉[11]的研究表明105 g·hm-2的咪鮮胺·多菌靈復配對油菜菌核病有較好的防治效果。農藥的混合使用或者濫用導致環境和農產品中農藥多殘留現象普遍。我國有超過70%的河流和地下水檢測出含有5種以上的農藥殘留[12]。本實驗室歷年檢測結果顯示，咪鮮胺和多菌靈在果蔬中檢出率較高，分別為21.41%和27.68%，且存在同時檢出的情況。

近年來，多個文獻報道了農藥聯合暴露對水生生物的聯合毒性研究。Wu等[13]研究了三唑磷與吡蟲啉聯合暴露對斑馬魚的聯合毒性。Wang等[14]報道了嘧菌環胺和醚菌酯對斑馬魚的聯合毒性。目前，有關咪鮮胺和多菌靈聯合暴露對水生生物的危害報道較少。本文以斑馬魚為模式生物，運用靜態法和實時熒光定量PCR方法，研究咪鮮胺和多菌靈，及其二元組合對斑馬魚胚胎的急性毒性和對斑馬魚幼魚甲狀腺軸相關基因表達的影響，以期為全面評估農藥復合污染風險提供必要的基礎數據，同時為農產品質量安全的監測預警提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：5415R臺式離心機(Eppendorf公司，德國)；RXZ-280智能光照培養箱(寧波江南儀器廠，中國)；StepOnePlusTM Real-Time PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)。

試劑：咪鮮胺(純度為97%，湖北正興源精細化工有限公司)；多菌靈(純度為99%，湖北康寶泰精細化工有限公司)；TakaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA試劑盒，購自大連Takara公司。

1.2 實驗材料

實驗魚：斑馬魚(Brachydaniorerio)，由浙江省農業科學院生態監測中心提供。無明顯的疾病和肉眼可見的畸形。斑馬魚飼養于恒溫(27±1) ℃魚房，保持14 h∶10 h光/暗條件，每天喂養2次新鮮孵化的豐年蝦。

魚卵收集：實驗前一天晚上，將成熟的斑馬魚以雌雄比1∶2的比例，配對放入產卵缸，次日清晨，開燈給予光照刺激使其交配產卵。收集魚卵，用系統水清洗并在顯微鏡下觀察，選取正常發育的胚胎，用于后續的暴露實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚胚胎急性毒性試驗

急性毒性試驗參照經濟合作與發展組織(OECD)的方法[15]，以24孔細胞培養板作為染毒容器，每孔放置1枚受精卵，每個濃度設置2個重復。根據預備實驗結果，設定咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的毒性試驗濃度(見表1)。分別于24、48、72、96 h時間點觀察并記錄死亡數和孵化數，及時取出死亡個體。根據卵是否出現白色凝結、小魚有無心率、血液是否流動等條件判斷斑馬魚死亡情況。

1.3.2 斑馬魚胚胎聯合毒性試驗

咪鮮胺和多菌靈聯合毒性試驗濃度設置為：以咪鮮胺和多菌靈單劑對斑馬魚胚胎的96 h-LC50作為各自的毒性單位，采用毒性單位1∶1的比例設置6個濃度梯度(見表1)，并設置1個空白對照(CK)。

聯合毒性評價按Marking的水生毒理聯合效應的相加指數法(Additional Index)進行評定[16]。公式如下：

S=Am/A1+Bm/B1+…

式中，S為生物毒性相加作用之和；A1,B1分別為A,B等毒物的毒性LC50值；Am,Bm為混合物毒性中各毒物的毒性LC50值[16]。

當S≤1時：AI=1/S-1.0；當S>1時：AI=1.0-S。

用相加指數法(AI)評價農藥的聯合效應：AI>0時為協同作用，AI<0時為拮抗作用，AI=0時為相加作用。

1.3.3 斑馬魚胚胎基因表達試驗

根據咪鮮胺和多菌靈單劑的LC50，設置高、中和低3個濃度和1個空白對照(見表2)。每個濃度設置3個重復，每個濃度隨機挑選100枚正常發育的胚胎放入500 mL燒杯中。將實驗組和對照組放入(26±1) ℃培養箱中暴露96 h，光暗周期為14 h∶10 h，每24 h更換一次藥劑。暴露結束后，每個濃度隨機挑選15條斑馬魚幼魚用于基因測定。

表1 咪鮮胺和多菌靈急性毒性實驗濃度設置Table 1 The concentration of prochloraz and carbendazim in acute toxicity experiments

按照試劑盒說明書的步驟進行RNA的提取和反轉錄；用Quawell超微量分光光度計測定RNA的濃度和純化質量；按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書在冰上配制20 μL反應體系；反應程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；72 ℃延伸20 s；所用基因引物序列參考常菊花[17]的報道(見表3)。

1.4 數據統計與分析

試驗數據用SPSS 7.5軟件進行整理和分析，以濃度的對數值作為自變量(x)，斑馬魚死亡率作為因變量(y)，建立“劑量-效應”線性方程，計算LC50和95%置信區間。

采用2-△△Ct方法[18]計算各基因mRNA的相對表達量，并通過T-test檢驗試驗組和對照組的差異顯著性(P<0.05、P<0.01表示差異顯著)，并用Origin 8.0軟件完成制圖。

2 結果(Results)

2.1 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎急性毒性

咪鮮胺對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為8.41 mg·L-1，根據現行毒性標準[19]屬于中毒(1～10 mg·L-1)，線性方程為y=4.71x-4.35，95%置信區間為4.75～10.35 mg·L-1，咪鮮胺對斑馬魚胚胎的LC50值隨著暴露時間的增加而降低(見表4)。

多菌靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為0.81 mg·L-1，屬于高毒(0.1～1 mg·L-1)，線性方程為y=4.59x-0.41，95%置信區間為0.57～1 mg·L-1，多菌靈對斑馬魚胚胎的LC50值隨著暴露時間的增加而降低(見表4)。

表3 實時熒光定量PCR引物序列Table 3 Primers used for quantification of mRNA expression by real-time PCR

表4 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的急性毒性Table 4 Acute toxicity of prochloraz and carbendazim to zebrafish

2.2 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎聯合急性毒性

咪鮮胺對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為5 mg·L-1，線性方程為y=2.9x-2.03，95%置信區間為1.46～30.27 mg·L-1；多菌靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為0.61 mg·L-1，線性方程為y=7.08x+1.52，95%置信區間為0.52～0.71 mg·L-1。相加指數法計算結果表明，在24～96 h內，AI值均小于0，表現為拮抗作用(見表5)。

2.3 斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因表達

本實驗選取了6種斑馬魚甲狀腺軸上關鍵基因，來探究不同濃度的咪鮮胺、多菌靈及其二元組合對斑馬魚甲狀腺軸基因表達的影響。6種基因分別為：促甲狀腺激素釋放激素(CRH)、促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺激素受體(TRα)、脫碘酶(D1、D2)基因和甲狀腺激素轉運蛋白(TTR)。

(1)咪鮮胺、多菌靈和二元組合與對照組的基因表達比較

咪鮮胺抑制斑馬魚幼魚體內的CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達，對TTR基因的表達沒有顯著影響(圖1)。暴露于低濃度咪鮮胺，斑馬魚幼魚體內的CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達量分別下調99%、98%、61%、99%和99%，影響最為顯著；暴露于中濃度咪鮮胺，CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達量分別下調82%、85%、50%、87%和80%；暴露于高濃度咪鮮胺，CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達量分別下調37%、9%、39%、99%和95%。隨著咪鮮胺暴露濃度的增加，斑馬魚體內的CRH、TSH和TRα基因的表達逐漸上調。

多菌靈抑制斑馬魚幼魚體內的CRH、TSH、D1和D2基因的表達，對TTR基因的表達沒有顯著影響，不同濃度的多菌靈對TRα基因表達的影響存在差異(圖1)。暴露于低濃度多菌靈，斑馬魚體內的CRH、TSH、D1和D2基因的表達量分別下調89%、87%、93%和85%，TRα基因的表達量上調36%；暴露于中濃度多菌靈，CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達量分別下調96%、94%、64%、62%和97%；暴露于高濃度多菌靈，CRH、TSH、TRα和D1基因的表達量下調70%、62%、45%和91%。

二元組合抑制斑馬魚體內的CRH、TSH、D1和D2基因的表達，對TTR基因的表達沒有顯著影響，且不同濃度的二元組合對TRα基因表達的影響存在差異(圖1)。暴露于低濃度二元組合，斑馬魚幼魚體內的CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達量分別下調94%、85%、72%、90%和95%；暴露于中濃度二元組合，CRH、TSH、D1和D2基因的表達量分別下調99%、98%、99%和99%，TRα基因的表達量上調37%；暴露于高濃度二元組合，CRH和TRα基因的表達量分別下調28%和51%，其他基因沒有顯著變化。

表5 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎聯合急性毒性Table 5 Combined acute toxicity of prochloraz and carbendazim to zebrafish

(2)二元組合與咪鮮胺、多菌靈的基因表達比較

二元組合對斑馬魚體內的TRα、TSH、D1和D2基因表達量的影響存在明顯差異。由圖1可知，暴露于0.11 mg·L-1咪鮮胺或0.01 mg·L-1多菌靈，TRα基因的表達量分別下調50%或64%，暴露于二元組合(0.11 mg·L-1咪鮮胺+0.01 mg·L-1多菌靈)，TRα基因的表達量上調37%；暴露于0.44 mg·L-1咪鮮胺，TSH、D1和D2基因的表達量分別下調9%、99%和95%，暴露于0.04 mg·L-1多菌靈，TSH、D1和D2基因的表達量分別下調62%、91%和21%，暴露于二元組合(0.44 mg·L-1咪鮮胺+0.04 mg·L-1多菌靈)，TSH、D1和D2基因的表達量與對照組相比沒有顯著差異。

圖1 咪鮮胺、多菌靈和咪鮮胺+多菌靈聯合暴露對斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因表達量的影響注：P表示咪鮮胺，C表示多菌靈，P+C表示咪鮮胺+多菌靈。CRH為促甲狀腺激素釋放激素基因， TSH為促甲狀腺激素基因，TRα為甲狀腺激素受體基因，D1、D2為脫碘酶基因，TTR為甲狀腺激素轉運蛋白基因。Fig. 1 Effects of different concentrations of prochloraz, canbendazim and prochloraz+canbendazim on the thyroid axis gene expression of zebrafish larvae Note: P denotes prochloraz; C denotes carbendazim; P+C denotes prochloraz+canbendazim. CRH stands for hormone releasing hormone gene; TSH stands for thyroid-stimulating hormone gene; TRα stands for thyroid hormone receptor gene; D1, D2 stand for deiodinase gene; TTR stands for thyroid hormone transporter gene.

3 討論(Discussion)

3.1 咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的單一和聯合毒性

咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值分別為8.41和0.81 mg·L-1，表現為中毒和高毒。這與咪鮮胺對斑馬魚胚胎96 h-LC50值為8.5 mg·L-1[20]，多菌靈對斑馬魚胚胎96 h-LC50值在0.85～1.6 mg·L-1范圍內[21]的結果類似。有研究表明，咪鮮胺對斑馬魚幼魚的96 h-LC50值為1.45 mg·L-1[22]，對斑馬魚成魚96 h-LC50值為4.6 mg·L-1[20]；多菌靈對斑馬魚成魚96 h-LC50值為7.64 mg·L-1[23]，對日本青鳉幼魚、仔魚96 h-LC50值分別為20.54和12.47 mg·L-1[24]。由此可見，不同種類的農藥對不同生物不同發育階段的毒性是不同的。在等濃度配比下，咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值分別為5和0.61 mg·L-1，聯合毒性表現為拮抗效應，其結果與楊桂玲等[25]以HepG2肝臟細胞為試驗材料所得的結果是一致的。

3.2 咪鮮胺影響斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因的表達

在咪鮮胺對斑馬魚染毒試驗中，咪鮮胺對CRH、TSH、TRα、D1和D2基因的表達具有不同程度的抑制作用，且低濃度(0.03 mg·L-1)暴露組的抑制效果更為顯著(P<0.01)。結果表明，咪鮮胺對斑馬魚幼魚可能具有潛在的甲狀腺干擾效應，這與Brande-Lavridsen等[26]得到的咪鮮胺影響蝌蚪甲狀腺形態學變化的結論類似。甲狀腺軸相關基因的表達受到抑制可能會減弱甲狀腺激素的合成和分泌，從而抑制幼魚的發育。例如，CRH、TSH表達量下調可能會減弱下丘腦和垂體對甲狀腺組織的刺激作用，使甲狀腺激素的合成和分泌減少；D2基因是催化甲狀腺激素(T4)脫碘生成高活性三碘甲腺原氨酸(T3)的關鍵酶，將D2基因敲除后，斑馬魚的發育將嚴重滯后[27]；D1基因在促進T3的生成過程中發揮著重要作用[28]，D1和D2表達量同時下調，則可能會使T3的合成受到嚴重抑制；TRα基因表達量的下調，會導致甲狀腺激素合成受到抑制[29]。本研究中CRH、TSH、TRα、D1和D2基因表達量的下調，可能是因為甲狀腺激素合成受到抑制，從而使得與受體的結合減弱。

3.3 多菌靈影響斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因的表達

在多菌靈對斑馬魚的染毒試驗中，多菌靈抑制斑馬魚體內CRH、TSH、D1和D2基因表達。結果表明，多菌靈對斑馬魚幼魚具有潛在的甲狀腺干擾效應。可能的干擾機制為：多菌靈抑制斑馬魚體內的甲狀腺激素的合成，從而使得與受體的結合減弱。Barlas等[30]的研究表明多菌靈導致大鼠體內的T3激素含量升高，且對大鼠甲狀腺造成組織病理損傷。Gawande等[31]的研究表明多菌靈導致大鼠體內甲狀腺和腎上腺腺體組織病理學損傷。

3.4 聯合暴露影響斑馬魚幼魚甲狀腺軸基因的表達

與對照組基因表達相比，二元組合抑制斑馬魚體內的CRH、TSH、D1和D2基因的表達，對TTR基因的表達沒有顯著影響，且不同濃度的二元組合對TRα基因表達的影響存在差異；與咪鮮胺、多菌靈基因表達相比，二元組合(0.11 mg·L-1咪鮮胺+0.01 mg·L-1多菌靈)對斑馬魚體內的TRα、TSH、D1和D2基因表達量的影響表現出協同效應。結果表明，CRH、TSH、D1和D2基因是斑馬魚內分泌干擾分子毒性的重要靶位點，且不同劑量組對斑馬魚幼魚甲狀腺干擾效應存在差異。Wu等[13]研究發現三唑磷+吡蟲啉聯合暴露與單獨暴露相比，斑馬魚體內TSH、D1和D2基因有顯著差異，且這些基因表達量的變化可為早期的分子預警。樓欽欽等[32]研究發現對于內分泌干擾物而言，其暴露于低劑量時可引起非劑量-效應關系。

綜上所述，咪鮮胺和多菌靈對斑馬魚胚胎毒性表現為中毒和高毒，聯合暴露表現出拮抗效應；咪鮮胺和多菌靈單劑對斑馬魚具有潛在的甲狀腺干擾效應，二元組合對斑馬魚幼魚體內的基因表達存在非劑量-效應關系。因此，在農藥的風險評估工作中，應充分考慮二者的聯合毒性效應。在未來的農藥登記管理以及農藥殘留限量標準制定中，單個農藥的評估應逐步向多殘留聯合暴露評估轉變，同時聯合毒性評價的結果也將需要應用到相關殘留限量的制定中。