3種抗生素對黑麥草種子萌發的生態毒性效應

鄧世杰，馬辰宇，嚴巖，葉曉楓，王國祥,2,*

1. 南京師范大學環境學院，南京 210023 2. 江蘇省地理信息資源開發與利用協同創新中心，江蘇省環境演變與生態建設重點實驗室，江蘇省水土環境生態修復工程實驗室，南京 210023

抗生素是一類天然、半合成或合成的化合物，主要用于殺死或抑制人或動物體內的微生物[1]。自1928年問世以來，抗生素的研制技術不斷發展，目前發現的抗生素已經達到數千種[2]。除在醫藥業作為藥物治療人類和動物疾病外，抗生素在農業上亦有廣泛應用，它可以作為肥料或畜禽飼料，提高動物、農作物的質量和產量[3]。抗生素及其代謝產物隨畜禽排泄物進入環境介質后，不易降解，能長時殘留，造成環境污染，危害人體健康，影響生態平衡[4]。我國是抗生素生產和使用大國，每年生產的抗生素超過200 000 t，國內消耗的約占75%[5]。其中四環素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素的使用量較大，但利用率不高，大部分以原藥的形式通過不同的途徑進入環境，對環境造成了嚴重的污染。并且，抗生素會在生物體內富集，通過生物放大，對人類健康和生態系統造成潛在的危害[6]。

抗生素對植物的生態毒性效應研究多集中于對植株的影響[7]。黑麥草(Loliumperenne)是一種一年生或多年生植物[8]，具有適應性強、生物量大和根系發達等特點[9-11]，被廣泛用于草坪草種植，兼有降解污染物的功效[12]。黑麥草對鎘和鉛等土壤重金屬有較強的富集作用[13]。在人工濕地研究上，它對污水中的總氮和總磷有很好的去除效果[14]。目前，抗生素對黑麥草的生態毒性效應研究主要是針對黑麥草植株，但抗生素對黑麥草種子的生態毒性效應尚未明確。而種子萌發是黑麥草生命周期的起始階段，是黑麥草植株生長發育的先決條件，對黑麥草植株生長發育起著至關重要的作用[15]。因此，有必要研究抗生素對黑麥草種子萌發的生態毒性效應。

本試驗以黑麥草種子為研究對象，研究四環素、環丙沙星和磺胺嘧啶3種抗生素在不同濃度處理水平下對黑麥草種子發芽、根長和芽長的影響，并探討了抗生素脅迫對黑麥草種子根、芽伸長抑制率的影響，以期為評價抗生素污染的生態影響提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗選擇發育正常的意大利黑麥草種子，供試所用黑麥草種子由江蘇省農業科學院提供。實驗使用的試劑為3類抗生素，分別為四環素(純度98%)、環丙沙星(純度98%)、磺胺嘧啶(純度98%)，均購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

種子經質量分數為50%的H2SO4處理除去穎殼，用體積分數為10%的H2O2溶液消毒10 min，之后用去離子水沖洗3遍，濾干。在直徑9 cm的培養皿中放入2張濾紙，用鑷子將20粒種子整齊地排列在培養皿中，加入10 mL抗生素溶液，濃度梯度設定為：0、0.1、0.5、1、5和10 mg·L-1，對照中加入等量的去離子水，每個處理3個重復。培養時，將培養皿置于25 ℃光照培養箱內，光照時間16 h·d-1，光照強度3 000 lx。

1.3 分析方法

1.3.1 發芽勢、發芽率、發芽指數及根長、芽長抑制率的測定

實驗期間每天測定種子的發芽率，直到種子的發芽率趨于穩定時，結束培養并測定根長和芽長，以此計算根長和芽長的抑制率。其中在第3天測定的種子發芽率為黑麥草種子的發芽勢。

發芽勢(%)=第3天時供試種子的發芽數/供試種子總數×100%[16]

發芽率(%)=供試種子的發芽數/供試種子總數×100%[16]

發芽指數(GI)=Σ(時間t的發芽數/相應的發芽天數)[16]

根長或芽長抑制率(%)=(對照組-處理組)/對照組×100%[16]

1.3.2 半數抑制濃度(IC50)的計算

建立種子的根長、芽長抑制率與對應的抗生素濃度的線性回歸方程，當根長、芽長抑制率為50%時，對應的抗生素濃度即為該種抗生素對根長、芽長的IC50值。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2013對數據進行處理，采用IBM SPSS Statistics 20統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗。本文中數據為3組平行試驗的平均值，或平均值±標準差。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素對黑麥草種子發芽率的影響

抗生素對黑麥草種子發芽率的影響如圖1所示。黑麥草種子在不同抗生素濃度處理下均在第3天發芽，表明抗生素不會引起黑麥草種子萌發期的變化，但對種子萌發的過程有一定影響。在黑麥草種子發芽初期，四環素對黑麥草種子發芽有促進作用，而環丙沙星、磺胺嘧啶有一定抑制作用。萌發過程第7天時，抗生素濃度超過5 mg·L-1時，四環素對種子發芽表現為促進作用，環丙沙星和磺胺嘧啶對種子發芽表現為抑制作用。磺胺嘧啶處理下，對照組的種子發芽率均高于其他處理水平，且與濃度10 mg·L-1處理組差異顯著(P<0.05)。第10天后，3種抗生素處理下黑麥草種子的發芽率均趨于穩定，且1 mg·L-1處理下種子的發芽率最高，該濃度實驗組的發芽率與各自對照組相比，差異不顯著(P>0.05)。四環素對種子發芽率的最大無作用濃度(NOEC)為5 mg·L-1，而環丙沙星和磺胺嘧啶對種子發芽率的NOEC為1 mg·L-1。有研究表明，一定濃度范圍的抗生素脅迫會提高植物種子活力，這可能是植物種子抵抗逆境的應激反應[17]。黑麥草種子雖經受抗生素對它的影響，但它可通過自身代謝反應阻止、降低或者修復由逆境造成的傷害，使其仍保持正常的生理活動，從而發芽率不會受到較顯著的負面影響，有時還可能得到促進[18]。而濃度過高時，植物種子的抗氧化酶系統受到破壞，有關酶活力降低[19]，從而抑制種子萌發。不同種類抗生素處理下，黑麥草種子萌發結果不同，主要因為3種抗生素理化性質有差異，對黑麥草種子的作用機制不同[20]。張乙涵等[21]研究表明，種子的種皮可阻礙抗生素脅迫對種子發芽帶來的負面影響，而種皮對不同抗生素的阻礙作用不同。并且種皮的阻礙作用是有限的，不能完全阻礙抗生素對種子的毒性效應[20]。本研究中，環丙沙星和磺胺嘧啶濃度達到10 mg·L-1時，種子發芽率受到顯著抑制(P<0.05)，說明此時抗生素已經對種子發芽產生了毒性效應。

2.2 抗生素對黑麥草種子發芽勢和發芽指數的影響

從表1可知，四環素處理下的黑麥草種子的發芽勢均高于對照組；而環丙沙星和磺胺嘧啶處理下，黑麥草種子發芽勢均低于對照組。隨著四環素濃度的增加，發芽勢呈現出先增加后降低的趨勢。濃度為1 mg·L-1時，種子的發芽勢最高，為65%，比對照組高15% (P<0.05)。在環丙沙星處理下，黑麥草種子發芽勢與濃度呈負相關，且各濃度的實驗組發芽勢均顯著低于對照組(P<0.05)。在磺胺嘧啶處理下，黑麥草種子發芽勢與其濃度呈負相關，對照組的發芽勢與0.1 mg·L-1組差異不顯著(P>0.05)，與其他各組差異顯著(P<0.05)。各四環素處理組的發芽指數均高于對照組，環丙沙星和磺胺嘧啶處理下發芽指數均低于對照組。但磺胺嘧啶處理下，種子的發芽指數總體上高于環丙沙星處理下的發芽指數。四環素對種子發芽勢的影響表現為促進作用，環丙沙星和磺胺嘧啶則表現為抑制作用。這可能是由于黑麥草對3種抗生素的吸收和降解能力存在差異。裴孟等[22]研究表明，黑麥草對四環素類抗生素的降解能力強于對磺胺類抗生素的降解能力，這可能與磺胺嘧啶的化學性質較四環素穩定有關。同時，抗生素對黑麥草根系區的微生物群落結構形成有一定影響，這會減弱黑麥草與微生物之間的養分循環，抑制種子發芽[23]。陳偉立等[24]的研究表明，植物的根系構型亦可影響植物的各項生態過程。本研究中，抗生素可通過對黑麥草根際處微生物的影響，間接調控黑麥草的根系構型，從而對其吸收水分、利用養分等生理與生態過程產生影響。

表1 3種抗生素處理下黑麥草種子的發芽勢和發芽指數Table 1 Germination potential and germination index of the seeds of Lolium perenne under three antibiotics stress

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note: compared with the control, *P<0.05.

圖1 3種抗生素對黑麥草種子發芽率的影響Fig. 1 Effects of three antibiotics on germination rate of Lolium perenne seeds

圖2 3種抗生素對黑麥草種子根長和芽長的影響注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig. 2 Effects of three antibiotics on root and bud length of Lolium perenne seeds Note: different letters in the graph represent significant differences (P<0.05), and the same letter represents no significant difference (P>0.05).

2.3 抗生素對黑麥草種子根長和芽長的影響

如圖2(a)所示，3種抗生素對黑麥草種子根長均有抑制作用。同種抗生素處理下，種子根長隨著濃度增加，均表現為先增加后減小。各濃度的四環素、環丙沙星和磺胺嘧啶處理下，種子根長均顯著低于對照組(P<0.05)。如圖2(b)所示，3種抗生素對種子芽長均有抑制作用。四環素作用下，隨著其濃度升高，芽長逐漸減小，各組種子的芽長均顯著低于對照組(P<0.05)。環丙沙星作用下，種子芽長隨著濃度增加，表現為先增加后減小，各組種子的芽長均顯著低于對照組(P<0.05)。磺胺嘧啶作用下，種子芽長的變化趨勢與環丙沙星的類似。由于3種抗生素濃度在0.1 mg·L-1時，種子的根長和芽長即受到抑制，因此，3種抗生素對種子根長、芽長的NOEC均在0～0.1 mg·L-1之間。

相關分析表明，四環素、環丙沙星和磺胺嘧啶對根長的IC50值分別為9.846、9.415和3.989 mg·L-1，R2值分別為0.869、0.806和0.969；而它們對芽長的IC50分別為27.506、24.686和21.767 mg·L-1，R2值分別為0.513、0.931、0.784。因此，3種抗生素對種子根長抑制率的相關程度高于芽長，對黑麥草種子根(芽)長的抑制作用強弱順序為：磺胺嘧啶>環丙沙星>四環素。

與芽長相比，根長受外界環境的影響更顯著。由于黑麥草幼苗根部直接與抗生素溶液接觸，對其中污染物的響應較為迅速，因此，根長對外界污染物較敏感[25]。鮑艷宇等[26]的研究表明，芽對外源污染物的敏感程度不如根。只有當抗生素濃度在黑麥草種子體內的積累超出其耐受范圍時，黑麥草種子芽長才會受到顯著抑制。本研究中，當抗生素濃度超過0.5 mg·L-1時，3種抗生素中磺胺嘧啶對根長的抑制作用最顯著；四環素、環丙沙星和磺胺嘧啶對種子根長的IC50也表明，磺胺嘧啶對種子根長的抑制作用最顯著。這與林琳等[27]、金彩霞等[28]的研究結果類似。這可能是由于磺胺嘧啶與四環素或環丙沙星相比，降解更為緩慢[29]，作用更持久，因而對黑麥草種子的生長影響更顯著。

綜上，本研究表明，3種抗生素對黑麥草種子的發芽期無影響，但對萌發過程有一定影響：3種抗生素在1 mg·L-1處理水平下均能促進種子發芽；四環素對種子發芽率的NOEC為5 mg·L-1，而環丙沙星和磺胺嘧啶對種子發芽率的NOEC為1 mg·L-1。3種抗生素濃度超過其對應的NOEC時，對黑麥草種子發芽即產生抑制作用。一定程度上，四環素對種子發芽勢有促進作用，而環丙沙星和磺胺嘧啶對種子發芽勢有抑制作用。四環素處理下發芽指數均高于對照組，環丙沙星或磺胺嘧啶處理下發芽指數均顯著低于對照組。在本試驗中，根長和芽長在3種抗生素作用下均受到抑制，NOEC均在0～0.1 mg·L-1之間。對3種抗生素的生態毒性敏感順序為：根長>芽長。黑麥草種子萌發受3種抗生素影響程度依次為磺胺嘧啶>環丙沙星>四環素。