蛤蚧及其混偽品基于12S rRNA序列的Bar-HRM鑒定研究△

蘇燕燕，丁丹丹，馬婷玉，向麗

中國中醫科學院 中藥研究所 中藥鑒定與安全性檢測評估重點實驗室，北京 100700

蛤蚧為我國名貴動物中藥材，其基原為壁虎科Gekkonidae壁虎屬動物蛤蚧(又名大壁虎)GekkogeckoLinnaeus，以除去內臟的干燥全體入藥，具有止咳、平喘、保肝、降血糖、提高機體免疫力及激素樣作用[1-4]，為臨床常用補虛藥[5-6]。因市場需求增大、人們大肆捕捉及生存環境的改變，蛤蚧野生資源驟減，現已列為國家二級保護動物和廣西省一級保護動物，市場上蛤蚧多為進口和養殖。由于蛤蚧、藏蛤蚧等形態相似，導致同名異物、同物異名的情況較為嚴重，市場常見壁虎、藏蛤蚧、石龍子、蜥蜴等混偽品[7-11]。近年來，越來越多的蛤蚧粉、蛤蚧膠囊等未經檢驗的藥材在電商平臺出售，嚴重威脅臨床用藥安全，亟需一種準確高效的鑒別方法規范藥材市場、保障藥材安全。

高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting，HRM)技術是指采用飽和熒光染料，結合實時熒光定量PCR技術，通過核酸熔解曲線分析，進而實現基因檢測、基因型分析的新型分子診斷技術[12-14]。因其具有靈敏度高、檢測快速、閉管操作避免污染、可實現高通量檢測、可選擇性測序等優點，逐漸應用于基因突變掃描、基因型分析、單核苷酸多態性(SNP)分析等研究[15-18]。此外，結合DNA barcoding的Bar-HRM技術逐漸形成，并成功應用于沙棘、蜂蜜等中藥、食品的鑒定研究中，具有重要應用價值[19-21]。

目前，蛤蚧相關的HRM鑒定研究未見報道，而動物通用條形碼線粒體細胞色素c氧化酶亞基I基因(cytochrome c oxidase subunit I，COI)序列長度大于600 bp，相較之下，片段長度約400 bp且能實現蛤蚧與混偽品鑒別的12S核糖體核糖核酸(Ribosomal Ribonucleic Acid，rRNA)基因序列則更為適宜[22-25]。因此，本研究以蛤蚧與其6種常見混偽品為研究對象[11，26-27]，基于12S rRNA序列對其進行HRM鑒別研究，并對市售蛤蚧粉進行檢測，以驗證該方法的可行性，完善了中藥蛤蚧的分子快速鑒定體系。

1 材料

1.1 實驗樣品

本研究所用動物樣品共48份，其中，蛤蚧10批次30份；蛤蚧常見混偽品無蹼壁虎Gekkoswinhonis、疣尾蜥虎Hemidactylusfrenatus、喜山巖蜥Laudakiahimalayana、石龍子Eumeceschinensis、東方蠑螈Cynopsorientalis和紅瘰疣螈Tylototritonshanjing各3份。此外，購買市售蛤蚧粉10份。動物樣品均經中國科學院昆明動物研究所蔣珂助理研究員鑒定，憑證標本保存于中國中醫科學院中藥研究所。本研究共得48條12S rRNA序列，均已提交至NCBI核酸數據庫(表1)。

表1 蛤蚧及其混偽品樣品信息

1.2 儀器及試劑

Scientz-48高通量組織研磨儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Qubit 3.0熒光定量儀[賽默飛世爾(美國)科技有限公司]；Rotor-Gene Q MDx實時定量PCR儀[凱杰(德國)生物技術有限公司]；血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；HRM分析試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；T-A克隆試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

2 方法

2.1 DNA提取

采用試劑盒法提取樣品總DNA[26]。所有樣品DNA均利用Qubit 3.0測定濃度，并調整為30～50 ng·μL-1。采用微量紫外分光光度計測定樣品DNA質量，OD260/280處于1.8～2.0的為優質；保存于-20 ℃冰箱備用。

2.2 蛤蚧12S rRNA序列擴增及數據分析

以10批次蛤蚧樣品DNA為模板，進行12S rRNA序列擴增[24]，采用凝膠電泳法檢測擴增結果，送北京諾賽基因組研究中心有限公司雙向測序。

通過軟件CodonCode Aligner V3.0對10批次蛤蚧的12S rRNA序列峰圖進行拼接剪切，在NCBI比對驗證后采用MEGA 6.0進行序列分析。

2.3 蛤蚧及其混偽品HRM-PCR擴增與Bar-HRM數據分析

以10批次蛤蚧的主要單倍型和6種常見混偽品的DNA為檢測對象。

HRM-PCR體系為25 μL，包含2×HRM PCR master mix 12.5 μL，正反向引物L1091/H1478(2.5 μmol·L-1)各1 μL，以1 μL DNA為模板，加RNase-Free Water補充至25 μL。

HRM-PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環35次；PCR反應完成后進入擴增產物的HRM曲線分析程序：熔解溫度從75 ℃逐漸升至95 ℃，每變化0.15 ℃收集一次熒光信號。蛤蚧及其混偽品的HRM-PCR產物均經測序驗證。

2.4 蛤蚧及其混偽品Bar-HRM數據分析

實驗中獲得的高分辨率熔解曲線均通過Rotor-Gene Q MDx version 2.3.1.49(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)進行分析；蛤蚧與其6種常見混偽品的HRM-PCR產物均經測序驗證，并采用MEGA 6.0進行序列分析。

2.5 靈敏度檢測

任取1份蛤蚧DNA，將質量濃度調整為50 ng·μL-1，并稀釋為25、10、5、1 ng·μL-1的DNA溶液，進行HRM-PCR實驗，研究DNA模板濃度與鑒定結果的關系。

2.6 蛤蚧摻偽檢測

以0、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%的比例將無蹼壁虎DNA與蛤蚧DNA混合，以摻偽DNA為模板進行HRM-PCR擴增，設蛤蚧為對照樣品，研究DNA摻偽比例與HRM曲線的關系。

2.7 市場蛤蚧粉鑒定

在市場購買10份蛤蚧粉，取樣約45 mg，以試劑盒法提取總DNA。利用HRM技術對其進行檢測：每份設置3個物理重復，以蛤蚧對照藥材DNA為陽性對照，并測序驗證。針對出現套峰的樣品進行T-A克隆檢測。

3 結果

3.1 蛤蚧12S序列分析

10批次30條蛤蚧12S rRNA序列，長度均為396 bp，可分為2種單倍型(圖1)，其中，單倍型H1有21條，單倍型H2有9條；共存在5個變異位點，分別為64位點的C-T變異，211位點的T-A變異，228位點的C-T變異，325位點的G-A變異和358位點的A-G變異。表明序列較為保守。

3.2 蛤蚧及其混偽品HRM分析

因10批次30份蛤蚧樣品中僅存在2種單倍型，因此，每種單倍型任選3份DNA與6種混偽品共同進行HRM實驗。根據圖2可知，蛤蚧與6種混偽品的12S rRNA-HRM曲線均具有不同的形狀特點，在歸一化熔解曲線(圖2A)和差異化熔解曲線(圖2B)中，蛤蚧的2種單倍型均可區分開，但相對于無蹼壁虎、疣尾蜥虎、喜山巖蜥、石龍子、東方蠑螈和紅瘰疣螈6種混偽品，蛤蚧的2種HRM曲線聚在一起。無蹼壁虎、石龍子和紅瘰疣螈的HRM曲線分別只有一種，表明這3個物種分別只有一種單倍型。而3份疣尾蜥虎的HRM曲線呈現出相近的2種，則

注：H1和H2表示不同單倍型。圖1 蛤蚧不同單倍型12S rRNA序列

該樣品的12S rRNA序列有2種單倍型；3份東方蠑螈和3份喜山巖蜥(藏蛤蚧)的HRM曲線均出現較小的差異，可能存在序列差異很小的不同單倍型，或者因實驗操作中加樣量不均一而導致曲線出現微小差異，需測序驗證。總體而言，蛤蚧及其6種常見混偽品均可通過HRM曲線進行鑒別區分。

注：A.歸一化熔解曲線；B.以蛤蚧為參考基因型的差異化熔解曲線。圖2 基于12S rRNA序列蛤蚧與常見混偽品的HRM曲線

3.3 蛤蚧及其混偽品DNA barcoding分析

所有HRM-PCR產物均經測序驗證。實驗共得48條12S rRNA序列，其中蛤蚧30條，混偽品18條，所有12S rRNA序列均在NCBI核酸數據庫進行BLAST比對驗證，比對到的最相近物種為自身物種，比對值為99%～100%。序列特征見表2。蛤蚧和6種常見混偽品的序列長度均小于400 bp，其中，無蹼壁虎的序列長度最長，為399 bp；喜山巖蜥的最短，為362 bp；蛤蚧的序列長度為396 bp。7個物種的平均GC堿基含量(鳥嘌呤G和胞嘧啶C在DNA 4種堿基中所占的比率)在40%～50%，其中，疣尾蜥虎的平均GC堿基含量最高，為50.0%；東方蠑螈的最低，為41.4%；蛤蚧的平均GC堿基含量為43.5%。

在本研究的7個物種中，無蹼壁虎、石龍子、東方蠑螈和紅瘰疣螈共4個物種的12S rRNA序列分別只有1種單倍型，種內無變異位點，序列較為保守；蛤蚧、疣尾蜥虎和喜山巖蜥分別有2種單倍型，其中，蛤蚧的12S rRNA序列含5個變異位點，喜山巖蜥有1個變異位點，疣尾蜥虎存在18個變異位點，種內差異較大；與HRM曲線分析結果相符。根據種內、種間遺傳距離分析結果顯示，7個物種的種內最大遺傳距離均小于其種間最小遺傳距離，表明蛤蚧及其6種混偽品可通過遺傳距離分析進行鑒別。此外，在NJ樹圖中(圖3)，蛤蚧和6種常見混偽品分別聚為一支，而且，自展支持率都高達99%，表明，蛤蚧及6種常見混偽品可通過構建NJ樹準確區分。

因此，經測序驗證，基于12S rRNA序列的DNA barcoding分析，蛤蚧與其6種常見混偽品可準確鑒別，而且各物種間也能準確區分，與HRM曲線分析結果相符，表明基于12S rRNA序列的HRM技術可實現蛤蚧及其6種常見混偽品的準確區分。

3.4 靈敏度分析

為研究DNA濃度對鑒定效果的影響，將蛤蚧DNA濃度調整為50、25、10、5、1 ng·μL-1，以此系列濃度DNA為模板進行HRM-PCR擴增。圖4顯示不同濃度蛤蚧樣品的HRM曲線聚在一起(圖4A)，Tm值為(81.11±0.03)℃(圖4B)，表明DNA濃度為1～50 ng·μL-1的蛤蚧樣品均可通過HRM-PCR檢出，且結果穩定。

表2 蛤蚧及常見混偽品12S rRNA序列特征

注：bootstrap 1000次重復，僅顯示自展支持率≥50%。圖3 基于12S rRNA序列蛤蚧及其混偽品的系統進化NJ樹

注：A.歸一化熔解曲線；B.DNA熔解曲線。圖4 基于12S rRNA序列蛤蚧HRM曲線靈敏度檢測

3.5 摻偽檢測

設置0、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%的DNA摻偽比例(無蹼壁虎/蛤蚧)，研究HRM技術對物種的檢出能力。不同摻偽比例得到的曲線不同(圖5)，以蛤蚧的HRM曲線為基準，曲線相似性隨著摻偽比例的增大而降低，當摻偽比例為1%時，該HRM曲線的相似性為99.07%(表3)。結果表明，基于12S r RNA序列的HRM曲線可實現蛤蚧的摻偽檢測，最低檢測限可達1%；而且，曲線相似性分析結果，對推算摻偽比例具有一定指導意義。

表3 不同摻偽比例HRM曲線基因型置信百分比 %

3.6 市場蛤蚧粉鑒定

在市場購買了10份蛤蚧粉，以基于12S rRNA序列的HRM技術其進行初步檢測，以鑒定其真偽。每份樣品進行3個物理重復，10份蛤蚧粉得30條HRM曲線(圖6)。其中，SY8的3條曲線單獨聚在一起，SY4、SY5、SY7的9條曲線聚為一類，其余6份樣品的18條HRM曲線聚為另一類，沒有與已知蛤蚧12S rRNA序列完全相同的樣品。推測曲線聚為一起的蛤蚧粉來源接近。經測序驗證，10份蛤蚧粉的測序峰圖均出現不同程度的套峰，具體表現為部分位點出現套峰，底峰較高。對出現套峰的樣品進行T-A克隆檢測，10份市場蛤蚧粉均檢測到多種蛤蚧單倍型，表明所購蛤蚧粉為混合樣品。

此外，SY1、SY2、SY3、SY6、SY9、SY10曲線呈現異常，經Qubit 3.0測定DNA濃度低于1 ng·μL-1，表明DNA降解嚴重，其原因可能為：炮制過程中溫度過高或時間過久；藥材存放時間較久；藥材肌肉組織含量少，如去尾后的蛤蚧。而且，經多次T-A克隆檢測，比對到羽螨屬Proctophyllodessp.物種和黑糞蚊。樣品疑似不潔。結合價格分析，SY6價格最低，為0.39元/g，另外5份售價為0.67～0.74元/g；而SY4、SY5、SY7和SY8的售價分別為0.60、0.56、0.56、1.60元/g，檢測結果無異常。推測SY1、SY2、SY3、SY9、SY10有以次充好的可能。

注：A.歸一化熔解曲線；B.以蛤蚧為參考基因型的差異化熔解曲線；C.DNA熔解曲線。圖5 基于12S rRNA序列蛤蚧摻偽檢測HRM曲線

注：A.歸一化熔解曲線；B.以蛤蚧為參考基因型的差異化曲線；C.DNA熔解曲線。圖6 市售蛤蚧粉HRM曲線

4 討論

蛤蚧作為我國名貴動物中藥材，相關鑒定研究多有報道，常用鑒定方法為形態鑒定、顯微鑒定、理化鑒定等傳統鑒定方法[11，28-29]。形態鑒定和顯微鑒定均需要長期從事中藥鑒定工作的專家完成，專業難度大，不易掌握；目前未發現蛤蚧的專屬特征性成分，《中華人民共和國藥典》中也未收載相關成分的含量測定方法，鑒定難度大。

目前，以DNA barcoding和特異性PCR方法為代表的分子鑒別技術較為高效。張紅印、GU等[26，30]均通過COI序列對蛤蚧及其10種易混物種和偽品進行了DNA barcoding鑒定研究，也有學者基于蛤蚧及其多種混偽品的COI、16S rRNA、Cytb、12S rRNA片段設計特異引物進行鑒別[25，27，31-32]。但是，DNA barcoding技術的精準鑒定主要依賴于PCR產物的測序，若大宗中藥材均采用測序檢測，一則檢測周期延長，二則測序成本高。而且，存放較久的樣品、炮制品以及深加工后的中成藥，因DNA降解，很難經傳統PCR擴增到較長的DNA片段，如700 bp左右的COI序列。特異性PCR檢測方法對于摻偽品則無法準確鑒別。

本研究以蛤蚧與其6種常見混偽品為研究對象，采用HRM技術進行鑒定研究。HRM技術靈敏度高，理論上可實現單個堿基的差異分析，且檢測快速[12，18，33]。結果顯示，蛤蚧、疣尾蜥虎和喜山巖蜥分別生成了2種峰型的熔解曲線，推測存在不同的單倍型，經測序驗證，與熔解曲線分析結果相符。因此，通過HRM鑒別，可實現同一個物種不同單倍型的區分，檢測靈敏度和特異性較強。而且，經Barcoding驗證分析，蛤蚧與6種混偽品均能通過BLAST分析、遺產距離分析、NJ樹分析區分開，表明蛤蚧及其6種常見混偽品可通過基于12S rRNA序列的Bar-HRM方法進行高效鑒別。

基于12S rRNA序列，對蛤蚧和無蹼壁虎進行摻偽檢測，根據曲線相似性分析，摻偽比例為1%時，曲線相似性為99%，表明摻偽最低檢測限可達1%。而Sakaridis等[34]針對驢肉的摻偽檢測研究，顯示出了更高的靈敏度，最低摻偽比例僅為0.1%。雖然不同物種、不同片段的擴增偏好性不同，但曲線相似性分析結果，對于評估藥材是否摻偽及摻偽比例仍具有一定參考價值。經對10份市場蛤蚧粉檢測發現，其中6份DNA濃度較低，且在后續T-A克隆檢測中發現螨屬和黑糞蚊物種，疑似存放不當，造成污染。

本研究基于12S rRNA序列建立的蛤蚧的Bar-HRM鑒別方法，為蛤蚧的快速鑒別、蛤蚧藥材的摻偽檢測及其質量評價提供了一定的技術支持，但蛤蚧的12S rRNA序列長度約為400 bp，對于深加工后的相關產品則很難檢測，還需進一步開發片段進行研究。