不同產地梅花鹿鹿茸礦物質元素含量測定與道地性分析△

趙海平，張國坤，姚夢杰，李春義，2*

1.中國農業科學院 特產研究所/吉林省特種經濟動物分子生物學省部共建重點實驗室，吉林 長春 130112；2.長春科技學院，吉林 長春 130022

鹿茸是梅花鹿CervusnipportTemminck或馬鹿CervuselaphusLinnaeus雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，作為珍貴的中藥材，也用來作為保健品的原料，具強筋健骨、壯腎陽、益精血等作用[2]，其多種藥用和保健功能得到了廣泛認可。《中華人民共和國藥典》將鹿茸的功能與主治敘述為：壯腎陽，益精血，強筋骨，調沖任，托瘡毒。我國市場上的鹿茸藥材約有80%產于梅花鹿[3]。梅花鹿鹿茸的道地產區一直是一個懸而未決的問題。梅花鹿養殖主要集中在東北地區[4]，因此業內人士一般認為，東三省是梅花鹿鹿茸的最佳產區。

道地性是藥材在特定環境中形成的綜合性特征，每種道地藥材都具其獨特的生態地理環境[5]，因此探索不同產地藥材所含成分的差異成為建立藥材道地產區檢測方法的有效手段之一，如結合相關的有機成分與微量元素來研究藥材的道地性[6]。

鹿茸中含有豐富的有機物質、礦物質和微量元素[7-14]。研究證明，不同產地鹿茸中次黃嘌呤[15]、蛋白多肽[16]、核苷類[17]等有機成分均有一定的差異。然而，目前尚未見關于不同產地鹿茸所含礦物質元素的對比研究。本研究采集了梅花鹿鹿茸主產區吉林省和非主產區山東省共7個地區鹿茸為研究對象，采用微波消解法處理樣品，運用微波消解-電感耦合等離子質譜(ICP-MS)分析技術隨機測定了鹿茸中18種礦物質元素的含量，以期為研究不同產區鹿茸的道地性提供參考。

1 儀器與試劑

密閉微波消解儀(型號：MARS5，美國CEM公司)；電感耦合等離子體質譜(ICP-MS，型號：7700X，美國安捷倫公司)；電熱鼓風干燥箱(型號：DHG-9013A，上海一恒儀器有限公司)；凍干機(型號：FDU-1100，東京理化公司EYELA系列)。

元素標準溶液包含Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au(中國計量科學研究院國家標準物質研究中心，質量濃度為100 μg·mL-1)；濃硝酸(優級純，國藥集團化學試劑有限公司)；30%過氧化氫(南京化學試劑股份有限公司)。

2016年7—8月在吉林省和山東省大型梅花鹿養殖場采取鹿茸42份，詳見表1；采樣方式：自二杠茸或三杈茸基部鋸取厚度為1 cm的鹿茸片。經由依托于中國農業科學院特產研究所的吉林省鹿茸工程技術研究中心鑒定為梅花鹿CervusnipponTemminck鹿茸。

表1 吉林省和山東省鹿茸樣品來源信息

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

標準溶液：元素(Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au)標準溶液的原始質量濃度為100 μg·mL-1，使用前稀釋至所需濃度。

標準曲線制作：配制Na、Mg、P、K、Ca混合標準曲線質量濃度為0、2、4、6、8、10 mg·L-1。Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au、Cd、Ag混合標準曲線質量濃度為0、5、10、20、50、100 μg·L-1。內標溶液選取一定體積的元素母液，用2%硝酸將其稀釋至10 μg·L-1。在選定的濃度范圍內做標準曲線，r均大于0.999 0，見表2，表明上述元素在0.3～100 μg·L-1線性關系良好。

表2 元素線性方程

2.2 鹿茸樣品預處理

準確稱取制備好的鹿茸樣品0.5 g于消解罐中，加入4.0 mL濃硝酸、1.0 mL 30%過氧化氫，混勻，蓋好內外蓋，置于微波消解系統內消解，消解條件見表3。消解完畢后冷卻至室溫，取出消解罐，將樣品轉移至50 mL容量瓶中定容，搖勻后待測。ICP-MS儀器工作條件：霧化室溫度2 ℃，等離子流14 L·min-1，蠕動泵速度25 r·min-1，等離子射頻功率1550 W，輔助氣體積流量0.79 L·min-1，霧化器體積流量1.0 L·min-1，KED測定模式。根據儀器靈敏信號進行對不同元素的同位素篩選之后，確定該檢測方法中各元素的質量數，見表4。

表3 微波消解條件

2.3 方法學考察

2.3.1 檢測限 連續測定空白溶液11次，以測定元素信號響應值的標準偏差的3倍所對應的濃度為檢測限，結果見表2，各元素的檢測限多處于10-12級別，方法靈敏度高。

2.3.2 精密度試驗 取18種元素的標準溶液各自連續進樣6次測定含量，18種元素的RSD為1.90%～2.70%，見表2，表明儀器的精密性良好。

2.3.3 重復性試驗 隨機取鹿茸樣品CC1 號6份，按2.2項方法制成待測溶液。測試研究涉及到的18種元素的RSD為1.80%～4.52%，說明方法的重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取鹿茸樣品CC1號，按2.2項方法制成待測溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h上樣，18種元素的RSD為1.21%～4.02%，表明樣品在24 h內是穩定的。

2.3.5 加樣回收率試驗 稱取已經測定的樣品CC1 0.5 g(5份)，精密稱量，精準加入一定量的各元素的對照品溶液，按照相同條件測試，計算各元素的回收率為96.90%～102.80%，RSD均在5%以下。

3 結果

3.1 不同產地鹿茸中18種礦物質元素含量及產地之間差異性分析

采用2.1和2.2描述的方法檢測不同產地42份樣品元素含量，結果見表5。從地區角度分析，Cr在各個地區鹿茸樣品中含量差異無統計學意義，其他元素差異有統計學意義(P<0.01)，如：Co含量四平地區的極顯著低于長春和吉林地區，Cd含量四平、長春和吉林3個地區差異有統計學意義。從省份角度分析，山東省4個產區鹿茸P和Ca含量高于吉林省3個產地，且差異有統計學意義(P<0.01)；元素Mg和Zn含量吉林地區鹿茸極顯著低于山東地區鹿茸；除臨沂樣品外，鹿茸元素K含量在吉林產區極顯著高于山東其他3個產區。Au在各個產地的大部分樣品中均未檢出。礦物質元素Ca和P在鹿茸中含量豐富，Ca和P含量比例接近2∶1。

表4 重復性、穩定性及加樣回收率試驗結果(n=6)

注：Na、Mg、Al、P、K、Ca含量單位是mg·kg-1；Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au、Cd、Ag含量單位是μg·kg-1，下同；—表示無數據。

表5 不同產地鹿茸中18種礦物質元素含量

注：上標相同字母或者不標字母表示差異無統計學意義(P>0.05)，不同小寫字母表示差異有統計學意義(P<0.01)。

3.2 相關性分析

相關性分析被廣泛應用到中藥材元素含量及其他營養成分分析中，通過對多個具備相關性的指標進行分析，從而衡量不同組分之間的聯系。本研究對鹿茸樣品中18種元素進行相關性分析。結果見表6。從表6可以看出，某些元素成分之間存在顯著或者極顯著相關性。Na與Mg、P、K、Ca、Mn、Cu、Zn、Se、Pb、Ba含量差異有統計學意義(P<0.01)；Mg與P、K、Ca、Cu、Zn、Se、Ba含量極顯著相關；P與K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se，Cd、Ba含量極顯著相關；K和Ca、Cu，Zn、Se、Pb、Ba含量極顯著相關；Ca與Fe、Cu、Zn、Se、Cd、Ba含量極顯著相關；Mn與Zn、Pb、Ba含量極顯著相關；Fe與Co、Cu、Cr、As、Cd含量極顯著相關；Co與Cr、As含量極顯著相關；Cu與Se、As、Cd含量極顯著相關；Zn含量與Pb、Ba含量極顯著相關。

3.3 主成分分析

通過SPSS軟件對所有樣品進行主成分分析，明確18種元素在吉林省和山東省不同產地鹿茸礦物質元素變異中各自的貢獻率，結果見表7。從表7可以看出，前2個主成分累計貢獻率達到91.88%，能夠闡明要說明的大多數變異信息。其中，第1個主成分(PC1)累計貢獻率為70.32%，主要反映的是來自Na、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、As、Cd、Ag、Pb、Ba的信息。第2主成分(PC2)累積貢獻率為21.56%，主要反映的是來自Mg、Cr、Ag、Ba的信息。

表6 鹿茸中18種礦物質元素皮爾遜相關性分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

表7 主成分載荷表

4 討論

東三省的氣候條件適合于梅花鹿的養殖，也是我國鹿茸的主要供應區，最有可能成為梅花鹿的道地產區。吉林省是我國梅花鹿茸產量最大的省份[18]。山東省雖然不是我國梅花鹿茸的主產區，但也是除東三省外產量最大的省份之一。本研究首次對梅花鹿茸主產區和非主產區的礦物質元素的含量進行比較分析，為研究鹿茸的道地性提供了理論和數據支持。

道地性是評價中藥品質優劣的傳統理論和方法，是中醫藥學經驗的科學總結，也是中醫理論在長久實踐過程中提煉出來的對中藥質量控制的客觀評價標準[19]，因此道地性作為中醫藥領域獨特的質量評價標準，其理念深深地根植于中醫理論體系中[20]。道地藥材存在化學成分物質基礎特性[21]，具體表現為活性成分的含量差異。礦物元素自身不能合成，必須從環境中攝取，因此不同產地產品有各自的礦物質特征[22-23]。此外，產品的貯藏時間和貯藏條件對其礦物元素含量影響較小[24-25]。因此，相對于有機物，礦物質元素更適合用于研究藥材的道地性。雖然不同產地鹿茸中次黃嘌呤[15]、白多肽[16]、核苷類[17]等有機成分均有一定程度的差異，但是上述研究中并沒有找到與鹿茸道地性單一相關的因素。

不同產地來源鹿茸礦物質元素差異分析結果表明，有幾種元素含量因產地不同而存在差異，如：Co含量四平地區極顯著低于長春和吉林地區；Cd含量四平、長春和吉林三個地區差異有統計學意義；山東省4個產區鹿茸P和Ca含量高于吉林省3個產地，且差異有統計學意義(P<0.01)；元素Mg和Zn含量吉林地區鹿茸極顯著低于山東地區鹿茸；除臨沂樣品外，鹿茸元素K含量在吉林產區極顯著高于山東其他3個產區等。因此，以某種或某些元素為指標，可以在一定程度上將不同產地的鹿茸進行區分。由于某些種類礦物質元素在鹿茸不同區段含量不同。因此，在通過礦物質元素研究鹿茸道地性時，需要排除鹿茸不同區段礦物質含量的影響。孫偉麗等[26]通過對梅花鹿三杈茸不同加工方式及不同區段20種礦物質元素含量的分析發現，Na、Mg、Al、P、K和Ca在不同區段之間含量差異有統計學意義(P<0.05)，Al、P、Ca、Na、Mg和K含量在煮炸茸和凍干茸兩種加工方式之間差異有統計學意義(P<0.05)。本研究所采集的樣品來自于鹿茸二杠或三杈的基部，在此部位Zn的含量不存在不同區段和加工方式的差異[26]。主成分分析顯示，前2個主成分PC1和PC2的累積貢獻率為91.88%，能夠解釋大部分變異，Zn位于第一類主成分中。因此，Zn含量可以作為單一相關的候選因素，研究鹿茸的道地性。相關分析顯示：Zn含量與Pb、Ba含量極顯著相關，說明Pb和Ba含量可以作為輔助指標。

重金屬元素在人體中蓄積到一定量會引發中毒癥狀，因為重金屬元素往往使蛋白質變性，影響組織細胞的生理功能，進而影響肝臟、腎臟、神經系統等功能。重金屬元素一直是衡量中藥材品質的關鍵因素[27]，《中華人民共和國藥典》2015年版限定了中藥材重金屬質量分數為Pb≤5.0 mg·kg-1、Cd≤0.3 mg·kg-1、Cu≤20 mg·kg-1、As≤2.0 mg·kg-1。鹿茸作為動物性來源中藥材也可能會因為動物攝入草食飼料、飲水等因素帶來重金屬超標問題。本研究通過《中華人民共和國藥典》2015版的ICP-MS法，測定的7個產地來源的42份鹿茸樣本重金屬Pb、Cd、Cu和As均無超標，符合我國中藥材重金屬的安全性規定，因此可以放心食用。