基于“成分-靶點-通路”的鹿茸網(wǎng)絡藥理學研究△

呂經(jīng)緯，李晶峰，邊學峰，張楠茜，張輝，孫佳明

長春中醫(yī)藥大學/吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117

鹿茸CerviCornuPantotrichum為鹿科動物梅花鹿CervusnipponTemminck或馬鹿CervuselaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。其性溫，味甘、咸，歸肝、腎經(jīng)，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[2]，具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒[1]的功能。鹿茸是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠完全再生的哺乳動物器官[3]，研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、多肽、脂類、礦物質(zhì)、激素、多胺、生長因子等成分[4-5]，是古今中外通用的名貴中藥材。現(xiàn)代藥理學研究表明，鹿茸具有壯腎陽、促智并改善記憶障礙、抗抑郁、抗衰老、抗疲勞、抗肝損傷、保護心肌、調(diào)節(jié)血糖、提高免疫功能、抗腫瘤及性激素樣作用等多種藥理活性[6]。

雖然有關鹿茸化學成分、藥理機制及臨床應用的研究不斷涌現(xiàn)[7-9]，但均未系統(tǒng)、整體地分析鹿茸中成分、靶點、通路和疾病的相互關系。網(wǎng)絡藥理學、整合藥理學等概念的相繼提出，以及分子生物學、生物信息學、計算機技術的不斷發(fā)展，為闡明中醫(yī)藥科學內(nèi)涵提供了新的思路與方法，其整合生物信息學、分子生物學及各大數(shù)據(jù)庫信息，系統(tǒng)地研究“成分-靶點-通路-疾病”之間相互作用，探究中醫(yī)藥“多組分、多靶點、多通路”的藥理機制，與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治、組方配伍、協(xié)同增效等原則不謀而合[10]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學的技術方法，探索鹿茸主要物質(zhì)基礎、關鍵靶點、疾病之間的相互作用關系，為進一步闡明鹿茸藥理機制提供新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 鹿茸成分與靶點挖掘

利用中藥分子機制生物信息學分析平臺BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)挖掘鹿茸的化學成分，并利用該服務器的“成分-靶點相似性”原理，設置閥值“Score cutoff=30”，計算化學成分對應的潛在靶點，最后利用Cytoscape網(wǎng)絡圖形處理軟件構建“化學成分-潛在靶點”網(wǎng)絡。BATMAN-TCM收錄了包括TCMID數(shù)據(jù)庫中的46 914個方劑、8159種中藥及25 210個中藥化合物，該平臺的靶點預測功能是基于Perlman等[11]的SITAR理念(Similarity-based Inference of drug-TARgets)，利用藥物靶點相似性原理來預測已知中藥化合物的潛在靶點，具有速度快、準確度較高的特點。

1.2 蛋白互作網(wǎng)絡構建與關鍵靶點篩選

為了明確鹿茸靶點群中的“關鍵靶點”，利用STRING平臺(https：//string-db.org/)構建靶點群蛋白互作網(wǎng)絡(protein protein interaction network，PPI network)，設置物種為“Homo sapiens”(智人)進行操作，最低相互作用閥值設為中等“medium confidence=0.4”，并用Cytoscape軟件的“Network Analyzer”功能對PPI網(wǎng)絡進行拓撲屬性分析，計算網(wǎng)絡整體的“節(jié)點度值分布(Node Degree Distribution)、介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)”2個重要拓撲參數(shù)，以Degree和Betweenness的均數(shù)為“卡值”，選取Degree和Betweenness同時在卡值之上的靶點為“關鍵靶點”，研究關鍵靶點可能的藥理作用。Degree反映了網(wǎng)絡節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)目，Betweenness是網(wǎng)絡中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑數(shù)目與最短路徑總數(shù)之比，Degree與Betweenness是衡量一個節(jié)點在網(wǎng)絡中重要性的兩個主要拓撲參數(shù)，也是判斷一個靶蛋白是否為“關鍵靶點”的重要依據(jù)[12]。

1.3 GO生物過程富集

關鍵靶點的GO生物過程注釋利用Cytoscape軟件中的“ClueGO”插件對鹿茸的關鍵靶點進行GO(gene ontology)生物過程富集，建立GO生物過程層級關系圖，分析關鍵靶點在體內(nèi)可能的生物過程。

1.4 KEGG信號通路分析

信號通路分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)將鹿茸關鍵靶點進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)信號通路富集，物種與背景設置均為“Homo sapiens”(智人)進行操作，研究關鍵靶點投射的KEGG信號通路與疾病之間的相互關系，明確鹿茸可能的藥理機制。

1.5 網(wǎng)絡圖構建和分析

Cytoscape 3.6.1構建鹿茸“成分-關鍵靶點-通路”網(wǎng)絡圖，利用Network Analyzer插件計算Degree值，網(wǎng)絡拓撲學分析成分、關鍵靶點及信號通路相互之間的關系，研究鹿茸可能針對潛在靶點和信號通路的治療作用及其發(fā)揮藥效的主要機制。

2 結果

2.1 鹿茸成分與潛在靶點

在BATMAN-TCM服務器共挖掘到鹿茸成分14個(見表1)，對應的潛在靶點306個。如圖1所示，14個正方形節(jié)點為鹿茸中的成分，306個六邊形節(jié)點代表鹿茸的潛在靶點，363條邊代表靶點和化學成分之間的相互作用，充分體現(xiàn)了鹿茸多成分、多靶點的特點。

2.2 蛋白互作與關鍵靶點分析

為研究各潛在靶點在體內(nèi)的相互作用關系，尋找關鍵靶點，將潛在靶點蛋白群進行PPI網(wǎng)絡分析(見圖2)，結果共發(fā)現(xiàn)212個靶蛋白可以發(fā)生相互作用，產(chǎn)生488條代表蛋白之間相互作用的邊，其中度值、介數(shù)越大顏色越深，說明蛋白相互作用越強。PPI網(wǎng)絡平均度值為4.60，平均介數(shù)為3.56×10-2，度值、介數(shù)超過平均值的靶蛋白共有26個(見表2)，說明這26個靶點在PPI網(wǎng)絡中處于關鍵位置，可能是鹿茸實現(xiàn)藥理效應的關鍵靶點。

2.3 GO生物過程富集

按照P值(校正)<0.01的標準，利用ClueGO插件對26個關鍵靶點進行GO生物過程富集研究。結果26個關鍵靶點可以參與體內(nèi)57個GO生物過程(見圖3)，包括G蛋白耦合受體蛋白信號通路的負調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成、前列腺發(fā)育、鈉離子輸送的調(diào)節(jié)等方面調(diào)控。

表1 鹿茸篩選后得到的14個成分

注： 表示鹿茸成分； 表示潛在靶點。圖1 鹿茸14個活性成分-306個靶蛋白網(wǎng)絡圖

注： 顏色由淺到深代表度值、介數(shù)從小到大。圖2 鹿茸靶蛋白PPI網(wǎng)絡圖

序號靶點中文名稱靶基因Uniprot IDDegreeBetweenness1Thyroid receptor-interacting protein 2甲狀腺受體相互作用蛋白2MED1Q15648220.230 2 2Adenylate cyclase type 1腺苷酸環(huán)化酶1型ADCY1Q08828180.071 4 3Retinoic acid receptor RXR-alpha 視黃醇受體RXR-αRXRAP19793160.111 8 4C-X-C chemokine receptor type 4CXC趨化因子受體4型CXCR4P61073140.060 2 5Estrogen receptor雌激素受體ESR1P03372130.174 5 6D(2)dopamine receptorD(2)多巴胺受體DRD2P14416130.070 3 7Mu-type opioid receptorMu型阿片受體OPRM1P35372130.058 5 8RAC-alpha serine/threonine-protein kinaseRAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1P31749110.376 4 9Retinoic acid receptor RXR-gamma視黃醇受體RXR-γRXRGP48443110.238 5 10Cytosolic purine 5′-nucleotidase細胞溶質(zhì)嘌呤5′-核苷酸酶NT5C2P49902110.091 4 11Sodium channel subunit beta-2鈉通道亞基β-2SCN2BO60939100.059 9 12Sodium channel subunit beta-1鈉通道亞基β-1SCN1BQ0769990.057 4 13Sodium channel subunit beta-3鈉通道亞基β-3SCN3BQ9NY7290.057 4 14Retinoic acid receptor alpha維甲酸受體αRARAP1027690.228 1 15Catenin beta-1連環(huán)蛋白β-1CTNNB1P3522280.088 3 16Mothers against decapentaplegic homolog 3母親反對decapentaplegic同系物3SMAD3P8402280.049 0 17Beta-adrenergic receptor kinase 1β-腎上腺素能受體激酶1ADRBK1P2509880.374 1 18cGMP-inhibited 3′,5′-cyclic phosphodiesterase BcGMP抑制3′,5′-環(huán)磷酸二酯酶BPDE3BQ1337070.209 5 19Growth factor receptor-bound protein 2生長因子受體結合蛋白2GRB2P6299360.041 7 20Lecithin retinol acyltransferase卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶LRATO9523760.036 4

續(xù)表2

注： 表示病毒對宿主形態(tài)或生理的調(diào)節(jié)； 表示G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號通路負調(diào)節(jié)； 表示一氧化氮生物合成過程； 表示前列腺發(fā)育； 表示環(huán)化酶活性的調(diào)節(jié)； 表示分支結構形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)； 表示鈉離子轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)。圖3 鹿茸57個GO生物過程

2.4 KEGG信號通路分析

將26個關鍵靶點進行KEGG信號通路富集研究，結果按照lgP值共篩選出7大類68條信號通路，如圖4、表3所示，包括雌激素信號通路、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等特定類型癌癥通路，縫隙連接、Rap1信號等免疫系統(tǒng)通路，趨化因子等信號轉(zhuǎn)導通路，白細胞跨內(nèi)皮遷移、Wnt信號等抗腫瘤通路以及物質(zhì)依賴性、內(nèi)分泌系統(tǒng)等通路。

2.5 生物通路分析

通過Cytoscape 3.6.1構建“成分-關鍵靶點-通路”網(wǎng)絡圖(見圖5)，包含108個節(jié)點(14個成分、26個關鍵靶點和68條生物信號通路)和285條邊，其四邊形代表鹿茸成分，圓形代表關鍵靶點，三角形代表信號通路，線代表成分、關鍵靶點和信號通路之間的關系。其度值較大的成分有三磷酸腺苷、視黃醇、17-β-雌二醇，度值分別為10、6、3，其分別與10個、6個、3個關鍵靶點相關。其度值較大的靶點有AKT1、GRB2、PRKCA，度值分別為51、34、33，其分別與51條、34條、33條信號通路相關。其度值較大的信號通路有癌癥信號通路、甲狀腺激素信號通路、癌蛋白多糖信號通路，度值分別為10、7、6，其分別與10個、7個、6個關鍵靶點相關。

注： 顏色越深代表富集到該通路的基因數(shù)越多。圖4 鹿茸7條主要KEGG信號通路富集圖

3 討論

通過對鹿茸“成分-關鍵靶點-通路”網(wǎng)絡進行分析，發(fā)現(xiàn)鹿茸14個成分分別調(diào)控26個關鍵靶點，Clue GO分析得到7個子簇57個GO生物過程及7大類68條KEGG信號通路，呈現(xiàn)出鹿茸多成分、多靶點、多通路整合調(diào)節(jié)作用的網(wǎng)絡特點。其中，鹿茸成分三磷酸腺苷、視黃醇和氨基葡萄糖分別通過ADCY1、AKT1、CTNNB1、GRB2、SMAD3、PRKCA、RARA、RXRA、RXRG、CXCR4 10個關鍵靶點直接作用于癌癥信號通路(表3，1)。將網(wǎng)絡分析結果與文獻報道進行相互印證可見，三磷酸腺苷具有較強的抗人食管癌細胞增殖作用[13]，視黃醇代謝相關基因LRAT和RDH12對宮頸鱗癌細胞具有抑制效果[14]，氨基葡萄糖具有抗腫瘤和免疫增強作用[15]。PI3K/Akt信號通路(表3，37)是癌癥信號通路(表3，1)中重要途徑，是調(diào)控腫瘤發(fā)生的重要通路之一[16]。

表3 鹿茸7大類68條KEGG信號通路及相關靶基因

續(xù)表3

續(xù)表3

注： 表示鹿茸成分； 表示潛在靶點； 表示潛在通路。圖5 鹿茸成分-關鍵靶點-通路網(wǎng)絡圖

徐婷婷[17]報道特異性誘導視黃醇X受體RXRA形成RXRA-LBD四聚體可阻止PI3K/AKT信號通路激活從而抑制癌細胞增殖。網(wǎng)絡分析結果顯示視黃醇可直接作用于視黃醇X受體RXRA，推測鹿茸可能通過作用于此靶點從而影響癌癥信號通路發(fā)揮藥效。從圖5分析推測三磷酸腺苷、視黃醇和氨基葡萄糖是鹿茸潛在的抗腫瘤成分，并通過癌癥通路、PI3K/AKT等信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，鄒三鵬等[18]研究發(fā)現(xiàn)17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細胞的侵襲；曹容華等[19]研究表明接種腫瘤后同時注射前列腺素E1 7 d對腫瘤有抑制作用。網(wǎng)絡分析結果顯示鹿茸中17-β-雌二醇、前列腺素E1能夠作用到ESR1、Med1、PRKCA關鍵靶點，推測鹿茸可能通過作用于這些靶點從而影響癌蛋白多糖等信號通路發(fā)揮藥效。結合文獻報道以及網(wǎng)絡分析結果，表明鹿茸在治療腫瘤疾病方面具有潛在的優(yōu)勢。

盧賀等[20]發(fā)現(xiàn)鹿茸調(diào)節(jié)cAMP/cGMP信號通路(表3，59)歸經(jīng)于腎臟、肝臟發(fā)揮治療骨關節(jié)炎的作用，并可以激活Smad3蛋白(表2，16)，調(diào)控軟骨細胞增殖和分化促進關節(jié)軟骨的修復，從而對骨關節(jié)炎大鼠起到治療作用[21]。石曉征等[22]發(fā)現(xiàn)梅花鹿茸Ⅰ型膠原可激活Wnt信號通路(表3，68)，顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度。李文凱等[23]研究表明三磷酸腺苷可通過促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨轉(zhuǎn)化治療骨質(zhì)疏松。網(wǎng)絡分析結果顯示三磷酸腺苷可通過AKT1蛋白直接作用于骨細胞分化信號通路(表3，32)；同時，17-β-雌二醇也能夠通過AKT1靶點直接作用于骨細胞分化信號通路，表明鹿茸可能通過作用于此靶點影響骨細胞分化信號通路發(fā)揮藥效，推測鹿茸在抗骨關節(jié)炎、治療骨質(zhì)疏松癥方面具有潛在的優(yōu)勢。

網(wǎng)絡藥理學挖掘鹿茸中含有17-β-雌二醇、雌酮等雌激素，長期服用外源性雌激素是乳腺癌發(fā)生的高危因素之一[24]。有研究證實短期(小于5年)、單純雌激素制劑的藥物應用不增加乳腺癌的風險，而長期(超過10年)、雌孕激素聯(lián)合用藥等情況將增加乳腺癌的風險[25-27]，由此可見乳腺癌危險的增加取決于雌激素的劑量和治療時間。鹿茸中雌激素主要包括雌二醇、雌酮，其中梅花鹿茸中雌二醇、雌酮質(zhì)量分數(shù)分別為0.103、0.289 μg·g-1，馬鹿茸中雌二醇、雌酮質(zhì)量分數(shù)分別為0.090、0.434 μg·g-1[28]，其雌激素含量較低，且鹿茸作為中藥長期服用的情況也很少見。但值得注意的是，對于有乳腺癌病史的患者，還應充分評估患者風險，準確掌握鹿茸用藥指征。

本文從網(wǎng)絡藥理學角度探討并揭示了鹿茸的主要成分、作用靶點、相關生物信號通路。網(wǎng)絡分析推測鹿茸除了在抗骨關節(jié)炎、治療骨質(zhì)疏松癥的作用之外，在抗腫瘤方面具有潛在的優(yōu)勢。本文為進一步研究鹿茸的作用機制提供理論參考，為鹿茸的進一步開發(fā)應用提供科學依據(jù)。