中華地鱉蟲腸道內生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究△

李娜，李凡，胡高升，趙玥，賈景明

沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016

昆蟲含有大量的昆蟲腸道菌，包括許多昆蟲致病菌及互惠共生菌等。一些腸道微生物生活在昆蟲腸道內并與宿主一起進行協同進化，在進化的過程中逐漸形成了自己獨特的代謝途徑，并且發生了形態化及基因型變化[1-2]。研究表明，一些腸道共生菌能夠為宿主提供一些宿主需要的重要營養物質，幫助宿主抵御一些致病菌的抗生素，還會產生一些活性次生代謝產物，促進宿主的生長，提升競爭能力。昆蟲與微生物保持多樣的共生關系，這種共生關系可能對宿主昆蟲具有重要的生存意義，如半翅目蚜蟲共生菌Buchnerasp.和紅兵臭蟲共生菌Coriobacteriumsp.為宿主提供昆蟲不能合成的維生素B族化合物[3-4]；白蟻腸道菌Bacteroides和Citrobacter為宿主昆蟲清理腸道內的含氮有機廢物[5]；某些兼性共生菌可以產生活性小分子代謝產物，幫助宿主昆蟲抵御致病菌和外來天敵入侵等。研究者將共生菌產生的活性小分子應用于藥學研究時發現，某些小分子具有明顯的抗菌、抗癌和免疫抑制活性，提示昆蟲共生菌作為新藥物來源的可能性[6-7]。作為新天然產物的來源之一，昆蟲共生菌正受到越來越多藥物化學家的關注。

中華地鱉蟲EupolyphagasinensisWalker又名地鱉蟲、土鱉蟲、土元等，為節肢動物門昆蟲綱蜚蠊目鱉蠊科昆蟲，是《中華人民共和國藥典》收載的常用中藥地鱉蟲的主要來源之一，雌蟲全體入藥，具有破瘀血、續筋骨等作用，用于筋骨折傷、瘀血經閉、癥瘕痞塊[8]。

近年來，關于地鱉蟲的研究主要集中在化學成分、藥理作用及保健作用方面[9]，而關于地鱉蟲腸道內生真菌的研究未見報道。因此，本文對中華地鱉蟲腸道內生真菌進行了分離鑒定，并對其次級代謝產物進行了抑菌活性研究，旨在為發現新型活性天然產物提供一條重要途徑。

1 材料

1.1 試劑與儀器

蔗糖(天津市大茂化學試劑廠)；蛋白胨(北京奧博星生物技術有限責任公司)；瓊脂粉(天津市科密歐化學試劑有限公司)；瓊脂糖(西班牙Biowest)；2×TaqMaster Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；硫酸鏈霉素、青霉素、EZup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程公司)；Marker DM2000(康為世紀生物科技有限公司)，其余試劑均為分析純。

超凈工作臺(上海樹立儀器儀表有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；生化培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)；振蕩培養箱ZQTY-50F(上海知楚儀器有限公司)；PCR儀(美國Life Technologies公司)；電泳儀EPS-300、水平電泳槽HE-120、Tanon-1600凝膠成像系統(上海天能科技限公司)；臺式高速冷凍離心機TGL-16(湘儀離心機儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計[尤尼柯(上海)儀器有限公司]；恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 實驗材料

研究材料為地鱉蟲，購于臨沂市興榮土元養殖合作社，由沈陽藥科大學中藥學院賈景明教授鑒定為中華地鱉蟲E.sinensis。

1.3 供試用病原菌

抑菌實驗用標準菌株為金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、白色念珠菌CMCC(F)98001，購于中國醫學細菌保藏管理中心。

1.4 培養基(自制)

麥芽浸汁瓊脂培養基(Malt Extracts Agar medium，MEA)：生麥芽20 g，加水煮沸30 min后過濾取汁，加入蔗糖20 g、蛋白胨1 g、瓊脂20 g、去離子水1000 mL，高壓滅菌備用。不加瓊脂為相應液體培養基(ME)。牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、去離子水1000 mL，高壓滅菌備用。沙氏培養基：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、氯化鈉5 g、瓊脂14 g、去離子水1000 mL，高壓滅菌備用。

2 方法

2.1 內生真菌分離及純化

地鱉蟲饑餓24 h，無菌條件下，3.5%次氯酸鈉消毒2 min，75%乙醇浸泡3 min，無菌水沖洗5次，吸取最后一次沖洗液200 μL涂布平板，用于表面消毒檢查。用無菌剪刀解剖蟲體，取前腸和中腸置于無菌研缽中，加無菌水充分研磨，渦旋后離心，取上清液1 mL，十倍稀釋法稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等5個濃度(g·mL-1)，每個濃度取200 μL涂布于MEA培養基中，28 ℃倒置培養。待平板長出菌落后，反復多次劃線培養進行分離純化，得到單菌落。

2.2 內生真菌發酵產物提取

將已純化的菌株，接種至裝有75 mL ME培養基的150 mL錐形瓶中，于28 ℃、180 r·min-1搖床培養3 d作為種子液，再以5%的接種量接種到ME培養基中，180 r·min-1搖床培養7 d，雙層濾紙過濾后離心，取上清，過0.22 μm濾膜，用于抑菌活性初篩。將抑菌活性較好的內生真菌發酵培養7 d后，發酵液用4～6層紗布過濾后，乙酸乙酯及正丁醇等體積萃取3次，濃縮萃取液得發酵產物浸膏，甲醇溶解，4 ℃保存備用。

2.3 內生真菌發酵產物的抑菌活性

采用濾紙片法[10]進行內生真菌的抑菌活性研究。將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌，室溫活化5 h后接種至相應的液體培養基(牛肉膏蛋白胨液體培養基、沙氏培養基)于28 ℃，160 r·min-1搖床中發酵培養至A600為0.5。分別移取上述菌液各200 μL，分別均勻涂布于營養瓊脂培養基平板和沙氏固體培養基平板。將內生真菌發酵液從冰箱取出，將無菌濾紙片分別放于無菌培養皿中，吸取發酵液至無菌培養皿中，浸泡2 h后，用無菌鑷子夾取濾紙片，在培養皿邊緣處刮去多余液體，貼于實驗菌株平板。其中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌組設置硫酸鏈霉素(10 mg·mL-1)為相應的陽性對照，0.9%氯化鈉溶液為陰性對照；白色念菌珠組設置制霉菌素(0.1 mg·mL-1)為陽性對照，0.9%氯化鈉溶液為陰性對照。將貼好濾紙片的平板于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養18～24 h，觀察抑菌圈大小并測量。將抑菌效果較好的菌株進行發酵培養，按2.2項下方法進行萃取，用甲醇將乙酸乙酯層、正丁醇層及水層浸膏配成質量濃度為30 mg·mL-1的待測樣品，將無菌濾紙片分別放于無菌培養皿中，吸取待測樣品滴至無菌培養皿中，浸泡2 h，待甲醇完全揮干后，用無菌鑷子夾取濾紙片，貼于實驗菌株平板。將貼好濾紙片的平板于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養18～24 h，觀察抑菌圈大小并測量。

2.4 內生真菌的鑒定

將抑菌活性較好的菌株(DB-1)接種至液體培養基，于28 ℃，180 r·min-1搖床培養7 d，試劑盒法提取DNA，采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行擴增和測序。擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃后延伸5 min；4 ℃保溫2 min，35個循環。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送蘇州金唯智生物科技公司進行序列測定，所得序列在NCBI/GenBank數據庫中進行BLAST同源性分析。

2.5 內生真菌生長曲線

取菌種接種至裝有200 mL ME培養基的500 mL錐形瓶，于28 ℃，150 r·min-1振蕩培養3 d后，以5%的接種量將種子液接種至裝有200 mL ME培養基的500 mL錐形瓶中，于28 ℃，150 r·min-1振蕩培養，每天定時取3瓶，將菌絲和菌液分離，用蒸餾水洗凈菌絲上的菌液后放在蒸發皿中，放入60 ℃烘箱中烘干后稱質量，分別記錄10 d菌絲體的干質量。以生長時間為橫坐標，菌絲體干質量為縱坐標繪制生長曲線。

3 結果

3.1 內生真菌的分離

在表面消毒效果檢驗中，最后一次漂洗液涂板培養平板中，未發現有微生物生長，表明蟲體的表面消毒效果良好，證明所分離得到的內生真菌來源于蟲體腸道內部。通過分離純化，從地鱉蟲腸道共分離內生真菌8株。分別命名為DB-1～DB-8。

3.2 內生真菌發酵液的抑菌實驗結果

篩選出來的8株地鱉蟲腸道內生真菌的抑菌實驗，結果見表1。

表1 八株地鱉蟲內生真菌對供試病原菌的抑菌結果

注：-表示無抑菌圈；+表示有抑菌圈。

由表1可知，菌株DB-1對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌都有一定的抑菌作用，其余菌株則對3株供試病原菌均沒有抑菌作用，故選定DB-1進行進一步研究。

3.3 菌種鑒定結果

DB-1菌種的rDNA ITS序列結果如下：GTGAGGGGAAGT CTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAA-GTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCC-CGGTGCGAGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGC-TGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGGAT-CCCGTCTTAG-GGGCTCCCGAGGTCCCCAACGCCGA-CCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCG-GACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAA-TGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGC-AATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCA-TCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTT-TTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAA-ATAACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAAGAGTTTG-GTTGGTCCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTG-CGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACA-GTTTGGTATGGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAA-CTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCAACAGAA-ACCTTGTTACGACTATACTTCCCACCAAGGTGAACA-AAAAAAAGGTTGCCCGGCGGGGGTAGCCCGGGGGG-GGTCCACCCGACCCGGGCCGCGGAAGGACCACAAA-CTTATACTGTAGTCCTTCGGGATTTTATTTCTA。將序列結果在 NCBI(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進行BLAST比對分析，發現菌株DB-1的擴增片段的堿基序列與GenBank中Trichodermaatroviride的rDNA ITS序列(序列號為MG972798.1)同源性高達99%，由此證明DB-1為深綠木霉Trichodermaatroviride。圖1為菌株DB-1的菌落形態圖。

圖1 菌株DB-1的菌落形態圖

3.4 生長曲線

菌株DB-1菌絲干質量見表2，生長曲線見圖2。

表2 菌株DB-1菌絲干質量(n=30)

圖2 中華地鱉腸道內生真菌DB-1生長曲線圖

由圖2可知，DB-1菌株的生長周期為7～8 d，在第8天菌絲干質量達到最大，然后逐漸降低，之后達到平穩期。因此，研究DB-1菌株發酵產物的抑菌活性時，選擇培養時間為8 d。

3.5 DB-1菌株抑菌實驗結果

DB-1菌株發酵產物抑菌活性結果見圖3，抑菌圈直徑大小見表3。由表3可知，只有乙酸乙酯層具有抑菌活性，其他各部位(正丁醇層及水層)均沒有抑菌活性。

表3 DB-1發酵產物抑菌活性測試 cm

注：1E為乙酸乙酯層；1B為正丁醇層；1H 為水層；+為陽性對照；—為陰性對照。

4 討論

與化學合成藥物相比，微生物藥物具有微生物來源豐富；次級代謝產物結構新穎，活性獨特；生長周期短、代謝易于控制，可工業化生產且無環境壓力；可有目的進行生物合成改造等諸多優勢，具有廣闊的應用前景。

地鱉蟲是一種食性雜、不傳瘟、繁殖快的一類藥用昆蟲，非常容易飼養，猜測其腸道內應該具有抑制病原菌的內生菌。因此，本文從地鱉蟲腸道中分離出8株內生真菌，其中一株對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌具有抑制活性，經過鑒定為深綠木霉Trichodermaatroviride。深綠木霉為木霉屬TrichodermaPers.ex Fr.真菌，在分類上隸屬于半知菌類、叢梗孢目、叢梗孢科、叢梗孢科單胞亞科、頭孢霉族[11]，廣泛存在于植物根際土壤、葉圍、種子以及球莖等生態環境中[12]，是重要的酶和抗生素的生產菌株，主要產纖維素酶和丁質酶類以及木霉素、膠霉素、綠木霉素和抗菌肽等，是迄今為止用于防治植物病害的生防菌研究中利用最多的植物病原拮抗真菌[13]。

圖3 DB-1菌株發酵產物抑菌活性結果

本文對深綠木霉的發酵產物利用乙酸乙酯及正丁醇進行了萃取，在對各萃取部位進行抑菌實驗時，發現只有乙酸乙酯層具有抑菌活性，正丁醇層及水層均沒有抑菌活性，由此判定抑菌活性成分存在于乙酸乙酯層。但是，抑菌成分是什么，是否為抗生素類或者其他成分，是本課題組正在研究的內容。

因此，本課題組接下來對其發酵液中抑菌活性成分如何提取、產量與發酵條件之間有無關系以及活性成分能否作為藥用資源開發利用等問題進行研究。另外，在DB-1發酵培養過程中，發現其發酵液有一定的香味，其抑菌作用是否與其香味成分有關系以及其香味成分是什么，也是本課題組接下來要研究的工作，以期為篩選和研發新型藥物提供參考。