酚酸類自毒物質(zhì)微生物降解轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

李敏，張麗葉，張艷江，朱娟娟，馬海軍,*

1. 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021 2. 寧夏葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，銀川 750021

在有限土地資源上專一化和規(guī)模化的耕種，導(dǎo)致農(nóng)田土壤連作障礙問題日趨嚴(yán)重，成為制約現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一。連作障礙是作物與土壤綜合作用的結(jié)果，其中植物自毒作用被認(rèn)為是導(dǎo)致連作障礙的重要誘因之一[1-3]。對(duì)多種植物根系土壤進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，阿魏酸、對(duì)香豆酸和苯甲酸等酚酸類物質(zhì)是其根系分泌的主要化感自毒物質(zhì)[4-5]。相比增施有機(jī)肥、嫁接等措施，向土壤中添加有益微生物降解作物根系自毒物質(zhì)，能更加徹底有效地防治由該類物質(zhì)導(dǎo)致的連作障礙和土壤污染。然而，有機(jī)化合物微生物降解過程的環(huán)境健康效應(yīng)具有一定的不確定性，例如三氯乙烯經(jīng)微生物降解后生成毒性更強(qiáng)的一氯乙烯。因此，闡明微生物降解轉(zhuǎn)化酚酸類化合物的規(guī)律與機(jī)制，是應(yīng)用微生物防治酚酸類自毒物質(zhì)導(dǎo)致的連作障礙的重要前提。根據(jù)近年來的文獻(xiàn)報(bào)道，筆者重點(diǎn)介紹了已有微生物降解轉(zhuǎn)化酚酸類物質(zhì)的科研成果，并綜合分析了本領(lǐng)域需進(jìn)一步揭示的基礎(chǔ)科學(xué)問題。

1 酚酸類物質(zhì)的化感自毒作用(Allelopathic autotoxicity of phenolic acids)

化感作用(allelopathy)由德國(guó)科學(xué)家Molish于1937年首次提出，1984年Rice將其定義為植物(或微生物)向周圍環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)而影響鄰近植物(或微生物)生長(zhǎng)發(fā)育的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象[5-6]，是植物、微生物和土壤三者極其復(fù)雜的相互作用結(jié)果。自毒作用(autotoxicity)是植物化感作用的一種主要類型，指植株向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)，連同植物殘?bào)w與病原微生物的代謝產(chǎn)物一起對(duì)同種植物產(chǎn)生直接或間接的毒害作用。

酚酸類化合物以帶有活性羧基的苯環(huán)為分子骨架，苯環(huán)上多種取代基類型和取代位點(diǎn)構(gòu)成了分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的多樣性。酚酸類物質(zhì)的自然來源主要是在植物體內(nèi)通過莽草酸途徑合成[7]，因此普遍存在于高等植物組織中。近年的研究表明，酚酸類物質(zhì)具有較強(qiáng)的化感活性，是引起植物化感自毒作用的主要因素之一[8-11]。

自然條件下，根系分泌、花粉傳播和殘?bào)w的腐敗降解是植物體內(nèi)酚酸類物質(zhì)進(jìn)入周圍環(huán)境的主要途徑[5,12-13]。當(dāng)環(huán)境中酚酸類物質(zhì)的濃度積累到一定量時(shí)，即產(chǎn)生顯著的化感作用，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)對(duì)植物種子萌發(fā)及生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生毒害作用。酚酸類物質(zhì)主要通過改變蛋白質(zhì)和核酸的合成[14]、細(xì)胞膜的通透性能[14-15]、酶的含量與活性[7]、光合作用[16-17]等，對(duì)植物的生理代謝產(chǎn)生負(fù)面影響。在植物整個(gè)生命周期中，種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)階段對(duì)化感物質(zhì)最為敏感。例如，對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸、苯甲酸和香豆素是花生連作土壤中的主要酚酸類物質(zhì)，在根系土壤中累積達(dá)到一定濃度后均可對(duì)花生種子的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[18]；2 mmol·L-1肉桂酸能顯著抑制黃瓜種子的萌發(fā)率，降低幼苗生長(zhǎng)的鮮重、根尖數(shù)、根表面積、胚根和胚軸長(zhǎng)等指標(biāo)[19]。(2)對(duì)土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。隨著酚酸類物質(zhì)在植物根際的不斷累積，土壤中氮、磷和鉀等有效養(yǎng)分逐漸失衡，微生物的種群分布、多樣性和生物量等發(fā)生劣變[20-22]。以人工楊樹林為例，伴隨土壤中苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸和香草酸的累積，根際細(xì)菌數(shù)量明顯減少，而真菌數(shù)量增多[23]。對(duì)我國(guó)南方紅壤花生種植區(qū)土壤進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)的累積可導(dǎo)致土壤偏酸，土壤從細(xì)菌型逐漸向真菌型過渡的同時(shí)，病原真菌富集，而蔗糖酶、脲酶和磷酸酶等土壤酶活性則隨著連作年限的增加而降低，進(jìn)而造成土壤微生物區(qū)系失衡、地力衰竭，病蟲害加劇[24]。

從上述研究可以看出，隨著連作年限的增加，酚酸類自毒物質(zhì)在土壤中蓄積，導(dǎo)致作物品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低、病蟲害頻發(fā)等現(xiàn)象，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐產(chǎn)生嚴(yán)重負(fù)面影響，亟待研究解決。

2 微生物對(duì)酚酸類物質(zhì)的降解研究現(xiàn)狀(Research status of biodegradation of phenolic acids by microorganisms)

在自毒作用導(dǎo)致的作物連作障礙治理領(lǐng)域，接種有益微生物分解連作土壤中累積的化感自毒物質(zhì)，有利于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，有望成為一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)有效的措施[20]。近年來，研究者們已從自然環(huán)境、作物內(nèi)生菌和腸道微生物中分離、篩選獲得多種酚酸類物質(zhì)降解菌，并對(duì)其降解特性、轉(zhuǎn)化機(jī)理等做了一定程度的研究。

2.1 微生物菌種的分離篩選以及對(duì)酚酸類物質(zhì)的降解效能研究

眾多研究采用以酚酸類物質(zhì)作為唯一碳源的培養(yǎng)基，篩選得到了多種可降解酚酸類化合物的菌株，此方面的成果尤以國(guó)內(nèi)學(xué)者研究報(bào)道居多。

目前，已分離鑒定的微生物包括假單胞菌(Pseudomonassp.)[25]、粘紅酵母菌(Rhodotorulaglutinis)[25]、葡萄球菌(Staphylococcussp.)[26]、不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)[27]、曲霉菌(Aspergillussp.)[28]、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)[29]、擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsisliquidambari)[30]、微小桿菌(Exiguobacteriumsp.)[31]、固氮菌(Azotobactersp.)[20]、青藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescaeruleus)[32]等。它們對(duì)酚酸類物質(zhì)的最大降解濃度多在250 mg·L-1以下[33-34]，少數(shù)微生物可耐受1 000 mg·L-1的酚酸[25]。

就降解轉(zhuǎn)化效率而言，已篩選獲得的菌株在實(shí)驗(yàn)室搖瓶降解條件下，對(duì)酚酸類化合物均表現(xiàn)出較高的降解效能。例如，培養(yǎng)48 h后，擬莖點(diǎn)霉菌對(duì)250 mg·L-1肉桂酸的降解率達(dá)100%，同時(shí)菌體的生物量顯著增大[33]。葡萄球菌屬細(xì)菌在液體培養(yǎng)基內(nèi)經(jīng)72 h培養(yǎng)后，對(duì)100 mg·L-1阿魏酸的降解率可達(dá)99.97%[26]，微小桿菌培養(yǎng)96 h后對(duì)肉桂酸的降解率可達(dá)99%以上[31]。然而，考慮到土壤中蓄積的酚酸類物質(zhì)是連作障礙的潛在誘因，因此，土壤介質(zhì)中微生物對(duì)酚酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化行為更值得關(guān)注和研究。Zhang等[25]從竹林、稻田等土壤中分離獲得假單胞菌和粘紅酵母菌，分別研究了在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件和實(shí)際土壤介質(zhì)中的降解效率，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)基內(nèi)經(jīng)48 h培養(yǎng)后上述菌株對(duì)1 000 mg·L-1對(duì)香豆酸的降解率可達(dá)70%以上，而在土壤介質(zhì)中達(dá)到70%～80%降解率所需的降解周期則延長(zhǎng)到30 d，且土壤介質(zhì)的pH、溫度和共存金屬離子等條件對(duì)微生物的生長(zhǎng)和降解性能影響顯著，例如粘紅酵母菌無法在高于30 ℃的環(huán)境中生長(zhǎng)，假單胞菌無法在Co2+污染的土壤中生存。總體而言，目前微生物降解轉(zhuǎn)化酚酸的研究，多在實(shí)驗(yàn)室模擬體系中進(jìn)行，而相關(guān)實(shí)際土壤介質(zhì)中的降解轉(zhuǎn)化研究成果十分匱乏，需要進(jìn)一步填補(bǔ)。

就降解底物多樣性而言，目前所篩選分離的菌株往往可同時(shí)降解數(shù)種酚酸類物質(zhì)。以對(duì)香豆酸為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選得到的菌株，可同時(shí)有效降解阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛[25]。微小桿菌可對(duì)香草酸、阿魏酸和苯甲酸等近10種酚酸類物質(zhì)進(jìn)行有效降解[31]。從化學(xué)分子結(jié)構(gòu)角度分析，酚酸類物質(zhì)苯環(huán)母核上的取代基多為羧基、羥基和甲氧基，結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出的共性為微生物降解酚酸的底物多樣性奠定了基礎(chǔ)。自然界一種作物的根系土壤中，往往是幾種乃至十幾種酚酸類物質(zhì)共存[9-10]，因此具有較高降解底物多樣性的菌株，其潛在應(yīng)用價(jià)值也相應(yīng)提高。目前，微生物對(duì)單個(gè)酚酸的生物降解行為研究比較透徹，但對(duì)混合酚酸的生物降解行為的研究還未見報(bào)道。對(duì)比微小桿菌對(duì)單個(gè)酚酸的降解效能，發(fā)現(xiàn)對(duì)香豆酸、阿魏酸經(jīng)6 h降解即可達(dá)到100%去除率，而同樣條件下肉桂酸經(jīng)96 h降解才可達(dá)到相同降解效果[31]，即同一種微生物對(duì)酚酸類化合物的降解效能差異顯著。微生物對(duì)酚酸類化合物降解的選擇性還有待揭示。

2.2 微生物對(duì)酚酸類物質(zhì)的降解轉(zhuǎn)化機(jī)理研究

酚酸類化合物在微生物的降解作用下，分子結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的取代基較易發(fā)生降解轉(zhuǎn)化，這類反應(yīng)往往導(dǎo)致大分子的酚酸降解轉(zhuǎn)化為小分子酚酸或其他含苯環(huán)類小分子有機(jī)化合物。以肉桂酸及其衍生物為例，降解主要發(fā)生在苯環(huán)1號(hào)位丙烯酸基團(tuán)，而苯環(huán)母核則在降解過程中未被破壞。丙烯酸基團(tuán)在細(xì)菌作用下的代謝路徑如圖1所示。采用少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)降解阿魏酸，發(fā)現(xiàn)其分子結(jié)構(gòu)中丙烯酸基團(tuán)在多種酶的綜合作用下，有2種代謝路徑，一種是在阿魏酰基輔酶A合成酶(feruloyl CoA synthetase enzyme, FerA)作用下羧酸基團(tuán)被活化，后經(jīng)雙鍵加成、脫乙酰輔酶A等多個(gè)生化反應(yīng)歷程，最終轉(zhuǎn)化為醛基(圖1反應(yīng)①～③)；另一種直接在脫羧酶的作用下丙烯酸基團(tuán)發(fā)生脫羧反應(yīng)(圖1反應(yīng)④)[35-36]。擬莖點(diǎn)霉菌降解肉桂酸的過程中，檢測(cè)到苯乙烯、苯乙酮、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸和原兒茶酸等重要中間降解產(chǎn)物，揭示了丙烯酸基團(tuán)的另一種降解轉(zhuǎn)化路徑(圖1反應(yīng)④、⑥～⑦)[30]；利用固氮菌降解轉(zhuǎn)化對(duì)香豆酸時(shí)，檢測(cè)到對(duì)羥基苯甲酸和3,4-二羥基苯甲酸2個(gè)中間產(chǎn)物[20]，利用青藍(lán)鏈霉菌降解轉(zhuǎn)化對(duì)香豆酸時(shí)，檢測(cè)到對(duì)羥基苯甲酸為主要中間產(chǎn)物[32]，這均支持了這一降解轉(zhuǎn)化路徑。

對(duì)于酚酸類化合物結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)，在微生物降解轉(zhuǎn)化過程中能否開環(huán)裂解十分關(guān)鍵。微生物代謝降解苯酚已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，且表現(xiàn)出相似的代謝途徑：微生物在其生理代謝過程中，首先將苯酚羥基化形成鄰苯二酚，再經(jīng)過鄰位裂解或間位裂解將苯環(huán)開環(huán)[37-38]，降解為低碳化合物或者二氧化碳和水。此外，Jones等[39]報(bào)道煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)在以苯酚為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，除檢測(cè)到鄰苯二酚外，還發(fā)現(xiàn)中間產(chǎn)物對(duì)苯二酚；在進(jìn)一步代謝過程中，前者發(fā)生環(huán)內(nèi)裂解生成β-酮己二酸，而后者羥基化生成1,2,4-三羥基苯后，發(fā)生鄰位裂解生成己烯二酸。目前，少數(shù)研究報(bào)道顯示，以苯甲酸及其衍生物為底物時(shí)，微生物也能將其分子結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)裂解[30,40]。苯甲酸及其類似酚酸的主要降解路徑如圖2所示。例如，固氮菌A.chroococcum、A.vinelandii和A.beijerinckii可利用苯甲酸及對(duì)羥基苯甲酸類化合物作為碳源和能源生長(zhǎng)，前者轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚后發(fā)生間位裂解，而后者轉(zhuǎn)化為3,4-二羥基苯甲酸后，經(jīng)β-酮己二酸途徑代謝[40]。廣泛存在于草本植物和木本植物中的內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉菌在液體培養(yǎng)條件下可對(duì)600 mg·L-1的4-羥基苯甲酸進(jìn)行有效降解，48 h內(nèi)降解率可達(dá)94%以上；對(duì)其降解過程進(jìn)行跟蹤發(fā)現(xiàn)，經(jīng)羥基化、脫羧等步驟，4-羥基苯甲酸轉(zhuǎn)為鄰苯二酚，再進(jìn)一步發(fā)生鄰位裂解生成己二烯二酸，從而匯入三羧酸循環(huán)[30]。考慮到多種苯酚類衍生物具有潛在的生物及環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)，因此跟蹤酚酸類物質(zhì)微生物降解過程中苯環(huán)的歸趨，對(duì)于研究整個(gè)降解過程機(jī)制及環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)都至關(guān)重要。

微生物特性是影響其對(duì)外源物質(zhì)降解能力的重要因素之一[41-42]。已有研究結(jié)果顯示，酚酸類化合物微生物代謝轉(zhuǎn)化常涉及到脫羧、氧化和羥基化等過程，但不同微生物對(duì)酚酸類物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化程度存在較大差異。

圖1 肉桂酸類化合物苯烯酸基團(tuán)的代謝路徑Fig. 1 Metabolic pathways of acrylic acid groups in cinnamic acids and its analogues

圖2 苯甲酸類酚酸苯環(huán)代謝路徑注：TCA表示三羧酸。Fig. 2 Metabolic pathways of benzene ring in benzoic acid and its analogues Note: TCA stands for tricarboxylic acid.

3 本領(lǐng)域需進(jìn)一步闡明的基礎(chǔ)科學(xué)問題(Science issues that need to be further clarified in the field)

通過微生物手段解決土壤中累積的酚酸類自毒物質(zhì)，對(duì)防治由其導(dǎo)致的連作障礙、保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。然而要達(dá)到這一目標(biāo)，還需開展大量研究工作。在基礎(chǔ)理論研究領(lǐng)域，以下問題需重點(diǎn)關(guān)注。

(1)已有研究顯示，部分微生物對(duì)酚酸類化合物具有一定的降解效能，而降解速率和轉(zhuǎn)化程度存在顯著差別。篩選高效降解酚酸類化合物的新型菌株，闡明其中的降解轉(zhuǎn)化效能和規(guī)律，仍是今后本領(lǐng)域需繼續(xù)加強(qiáng)開展的工作內(nèi)容。

(2)目前已有的報(bào)道多集中在某種微生物對(duì)單一或少數(shù)幾個(gè)酚酸類化合物的降解轉(zhuǎn)化研究，而在實(shí)際環(huán)境中，一種作物根系往往共存幾種乃至十余種酚酸類物質(zhì)，特別是對(duì)于結(jié)構(gòu)中包含苯環(huán)的有機(jī)化合物，其生物降解由于苯環(huán)上取代基數(shù)量、位置和種類多樣而變得更加復(fù)雜，例如，氨基、甲氧基、硝基和砜基等的存在可顯著抑制其生物降解，而羥基、羧基則起到促進(jìn)作用[43]。對(duì)于以苯環(huán)為母核結(jié)構(gòu)、取代基類型和取代位點(diǎn)多樣的酚酸類物質(zhì)，微生物對(duì)其代謝轉(zhuǎn)化的選擇性、代謝轉(zhuǎn)化難易程度與其分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。微生物對(duì)該類化合物降解轉(zhuǎn)化效能與化合物分子結(jié)構(gòu)特征之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)有待揭示。

(3)在理想情況下，微生物降解轉(zhuǎn)化有機(jī)物的最終產(chǎn)物是無機(jī)離子、二氧化碳和水等，但實(shí)際降解過程往往是分多個(gè)步驟完成的，生成眾多中間產(chǎn)物的同時(shí)，很難達(dá)到徹底礦化去除的效果。因此追蹤識(shí)別中間降解產(chǎn)物并了解其歸趨，對(duì)于揭示降解轉(zhuǎn)化機(jī)理和評(píng)價(jià)降解過程的生物安全性十分必要。酚酸類化合物結(jié)構(gòu)中均包含苯環(huán)，部分微生物可將苯環(huán)裂解開環(huán)徹底礦化，而部分微生物只能對(duì)大分子酚酸類化合物進(jìn)行簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)化，苯環(huán)結(jié)構(gòu)仍舊存在于多種中間降解產(chǎn)物或最終降解產(chǎn)物中。由于眾多苯環(huán)衍生物不論對(duì)植物自身還是周圍環(huán)境均存在潛在的安全威脅，因此在微生物降解轉(zhuǎn)化酚酸類化合物的過程中，苯環(huán)的歸趨是評(píng)估整個(gè)降解過程是否安全、是否徹底的一個(gè)重要因素。現(xiàn)有研究報(bào)道，多采用LC-MS等分析手段，定性識(shí)別部分主要降解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，一定程度上揭示出苯環(huán)的歸趨。然而，僅定性定量篩查出具有潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的降解產(chǎn)物，尚不能夠完整反映降解體系整體的安全性，降解產(chǎn)物混合物中各組分疊加、協(xié)同或抑制等綜合生物效應(yīng)尚未明確。目前對(duì)降解轉(zhuǎn)化過程中的環(huán)境生物安全性研究較少，亟待填補(bǔ)。