機艙空氣環境耐藥基因及耐藥細菌的污染特征研究

李鵬，譚璐，李林云，薛銀鋼，毛大慶

1. 天津大學環境科學與工程學院，天津 300350 2. 南開大學醫學院，天津 300071 3. 南開大學環境科學與工程學院，教育部環境污染過程與基準重點實驗室，天津 300350 4. 常州市環境監測中心，江蘇省環境保護水環境生物監測重點實驗室，常州 213001

隨著抗生素在醫療行業以及畜牧業的濫用，耐藥細菌的全球性傳播已經成為威脅全球公共安全的重要問題之一。細菌的耐藥性一般由其攜帶的耐藥基因(ARGs)編碼產生，例如，攜帶β內酰胺耐藥基因NDM-1(blaNDM-1)的細菌能夠抵御8種以上的抗生素，被稱為“超級細菌”，而感染此類病菌的人將面臨無藥可治的狀況[1]。攜帶blaNDM-1的細菌首次于2008年在印度新德里被發現[2]，隨后迅速傳入其他國家，成為了全球關注的焦點，因此，研究人群的跨國遷徙對于耐藥細菌的全球傳播具有重要意義。隨著民用飛機安全性、舒適性和環保性的不斷提高，民航飛機現已成為國內外旅行的主要交通工具。據統計，每年全球飛機載客超過3百萬人次，在飛行過程中，人群處于低壓缺氧、低濕度、高人群密度的機艙內，為病毒及病菌的傳播提供了良好的條件[3-4]。由病毒引起的感染性疾病(如SARS和H1N1等)在飛行過程中的傳播擴散已經被頻繁報道[5-8]，然而，耐藥基因及耐藥細菌在機艙環境內的賦存及傳播還未有研究。

大氣環境中耐藥基因的研究相對較少，已有報道顯示，大氣中耐藥基因的研究主要包括動物飼養場[9-11]、污水處理廠[12]、醫院[13]、農貿市場[14-15]及室外[16]等。Li等[17]對污水處理廠中空氣研究發現，sul2和intI1兩種耐藥基因被檢出。陶墨奎[18]對醫院嬰兒室空氣中的1 333株葡萄球菌(Staphylococcus)研究發現，在所檢測的菌株中致病菌葡萄球菌所占比例為68.9%，所有菌株對常見的藥物如紅霉素(erythromycin)、四環素(tetracycline)和林可霉素(lincomycin)等都有較高的耐藥性。Xie等[19]在中國武漢的工業-城市-農村帶中發現，ermB、tetW和qnrS等抗性基因均都有檢出，且其細菌總數隨季節性變化。Zhou等[20]在中國三大城市(北京、天津和石家莊)城市的空氣塵埃樣品中檢出20種具有磺胺、四環素、大環內酯、β-內酰胺和氨基糖苷或喹諾酮類抗生素耐藥性的抗性基因；同時分離鑒定出80株耐藥細菌，其中有12株條件致病菌。

本研究采集了一架跨國航線客機機艙內高效空氣過濾器(high efficiency particulate air filter, HEPA)上截留的顆粒物，定量檢測了其中多種耐藥基因，同時對截留的細菌進行了分離、培養和鑒定，并且對這些細菌的8種抗生素耐藥表型進行了檢測，以期揭示飛行過程中機艙空氣介導的耐藥基因傳播的污染特征。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

樣品取于空客A320民用客機上第3次更換后的圓筒狀HEPA，圓筒高約28 cm，直徑為34 cm，HEPA的更換周期為3個月。使用無菌剪刀將HEPA圓筒外殼減掉，將內部過濾棉轉移至無菌密封袋中-20 ℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 HEPA顆粒物DNA提取

使用無菌剪刀將過濾棉剪裁成11 cm×23 cm的小塊，放入含有150 mL PBS溶液的錐形瓶中，220 r·min-1、37 ℃震蕩3 h，用0.22 μm濾膜過濾，再次加入PBS溶液，震蕩并過濾，重復上述過程直至溶液澄清。然后使用Water DNA Kit(Omega Bio-Tek, D5525-01)試劑盒按照說明書要求提取濾膜DNA。DNA提取過程中所使用的試劑及耗材全部經過滅菌處理。

1.2.2 耐藥基因定量分析

采用熒光實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR)的方法對機艙HEPA樣本中31種耐藥基因(包括β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、磺胺類、大環內脂類及喹諾酮類耐藥基因)以及Ⅰ類整合子特異基因(intI1)進行定量檢測，同時對16S rRNA基因進行定量檢測[21-23]。耐藥基因的相對含量定義為耐藥基因拷貝數與16S rRNA拷貝數的比值(ARGs copies/16S rRNA gene copies)。

1.2.3 細菌的分離與鑒定

將樣品剪碎溶于2 mL滅菌的1×PBS緩沖液中，渦旋振蕩30 min后，將溶液以10倍的梯度稀釋為2×、3×、4×和5×樣品緩沖溶液，取100 μL溶解后的樣品涂于LB培養基，每個樣品做2個平行，所有平板置于(35±2) ℃恒溫培養箱中培養24 h。培養后，觀察記錄菌落的形態特征，在LB平板上劃線純化細菌，置于(35±2) ℃恒溫培養箱中培養24 h。若為單一菌落，則用接種環挑取單個菌落置于5 mL培養基試管中，于37 ℃恒溫搖床培養箱中進行過夜培養。

將培養好的菌液進行細菌基因組DNA提取，取2 mL菌液置于離心管中，利用天根牌基因組試劑盒(TIANGEN)進行細菌DNA獲取。取5 μL PCR產物做瓊脂糖凝膠電泳實驗，然后將PCR產物送往北京奧科生物技術有限責任公司做序列測序。在NCBI網站上對測序結果進行序列比對，最終得到細菌菌屬鑒定結果。

1.2.4 細菌耐藥性檢測

將待測菌株接種于LB培養基中37 ℃過夜培養，使用生理鹽水(0.85% NaCl)稀釋至OD600=0.5；用二倍稀釋法分別配制含有環丙沙星(ciprofloxacin)、四環素(tetracycline)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole)、氨芐西林(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、鏈霉素(streptomycin)、慶大霉素(gentamycin)和亞胺培南(imipenem)的MHB培養基，質量濃度依次為0.5, 1.0, 2.0, …, 1 024 μg·mL-1，將稀釋好的菌液接種至含有抗生素的培養基中，37 ℃培養過夜；平板置于暗色、無反光物體表面上判斷實驗終點，以抑制細菌生長的最低抗生素質量濃度為待測細菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)值。根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)的標準對于細菌的耐藥性進行判定[24]。

2 結果(Results)

2.1 耐藥基因及Ⅰ類整合子定量分析

檢測結果表明，在選取的31種耐藥基因類型中，有5種耐藥基因類型(qnrA、blaVIM-1、tetM、tetO和ereB)的含量低于檢出限，有26種耐藥基因及intI1基因被檢出，包括3種磺胺類耐藥基因(sul1、sul2和sul3)，4種四環素類耐藥基因(tetA、tetC、tetQ和tetW)，6種氨基糖苷類耐藥基因(aac(6’)-Ⅱ、aacC2、aacC3、aacC4、strA和strB)，10種β-內酰胺類耐藥基因(blaAmpC、blaCMY-2、blaDHA-1、blaGES-1、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10、blaOXA-30、blaSHV-1和blaTEM-1)，2種大環內酯類耐藥基因(ermB、ermC)和1種喹諾酮類耐藥基因(qnrS)。耐藥基因的總體檢出頻率為83.9%，其相對含量如圖1所示。由圖可知，Ⅰ類整合子基因的相對含量最高，為3.94×10-1。檢測的10種β-內酰胺類耐藥基因的相對含量在1.51×10-5～1.26×10-2之間，其中含量最高的為blaCMY-2，含量最低的為blaGES-1；檢測的6種氨基糖苷類耐藥基因的相對含量在1.59×10-6～1.61×10-2之間，其中aac(6’)-Ⅱ的含量最低，為1.59×10-6，aacC2的含量最高，為1.61×10-2；檢測的4種四環素類耐藥基因的相對含量在4.87×10-5～1.29×10-2之間，其中tetC的含量最低，tetW和tetQ含量相對較高；檢測的3種磺胺類耐藥基因的相對含量都相對較高，sul2含量最高，為4.81×10-2；2種大環內酯類耐藥基因ermB和ermC的相對含量大致相同，分別為2.44×10-4和3.26×10-4；喹諾酮類耐藥基因qnrS的相對含量為3.92×10-4。

2.2 機艙氣溶膠細菌的分類與鑒定

從飛機空氣過濾網中總共分離鑒定出64株細菌，根據其16S rRNA片段序列在NCBI上的比對結果鑒定其種屬，分類結果如圖2所示。其中屬于厚壁菌門(Firmicutes)的細菌共31株，占比為48%，屬于變形菌門(Proteobacteria)的細菌有16株，占比為25%。放線菌門(Actinobacteria)共有10株，占比為16%，同時還分離出1株擬桿菌門(Bacteroidetes)的細菌。在屬分類水平上，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)27株，腸桿菌(Enterobacter)15株，微球菌(Micrococcus)10株，土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、金黃桿菌(Chryseobacterium)、土壤短波單胞菌(Brevundimonasterrae)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)、短桿菌(Brevibacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus)各1株。

圖1 26種耐藥基因及Ⅰ類整合子的相對含量Fig. 1 Relative abundance of 26 resistance genes and intI1

圖2 細菌在門和屬水平上的分類Fig. 2 Classification of bacteria at phylum and genus level

2.3 機艙氣溶膠細菌耐藥性檢測

對分離出的64株細菌的耐藥表型檢測結果如表1所示。從能夠耐受的抗生素的質量分數來看，對于磺胺甲惡唑的耐受性普遍較高，其中MIC>512 μg·mL-1的菌株有50株。對于四環素、氯霉素和鏈霉素的耐受性普遍較低，其MIC基本在16 μg·mL-1以下。根據CLSI的標準對于細菌的耐藥性進行判定，不同抗生素的耐藥菌株數如圖3所示，發現具有磺胺甲惡唑耐受性的細菌為50株(78.1%)，具有慶大霉素耐受性的細菌為41株(64.1%)，具有亞胺培南耐受性的細菌為24株(37.5%)，具有氯霉素耐受性的細菌為4株(6.3%)，具有四環素耐受性的細菌為4株(6.3%)，所有細菌對于環丙沙星均無耐受性。細菌多重耐藥特征如圖4所示，對分離出的細菌的多重耐藥特征進行分析發現，有3株細菌具有五重抗性，23株細菌具有四重抗性，11株細菌具有三重抗性，18株細菌具有兩重抗性。

圖3 不同抗生素耐藥菌株數目注：SMX、GEN、IMP、CHL、TET和CIP表示磺胺甲惡唑、 慶大霉素、亞胺培南、氯霉素、四環素和環丙沙星。Fig. 3 Number of strains resistant to different antibiotics Note: SMX, GEN, IMP, CHL, TET and CIP stand for sulfamethoxazole, gentamycin, imipenem, chloramphenicol, tetracycline and ciprofloxacin.

圖4 細菌多重耐藥性特征Fig. 4 Multidrug resistance characteristics of bacteria

表1 8種抗生素對分離菌株的最低抑菌濃度(MIC)Table 1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of 8 antibiotics on bacteria

注：菌株種的確定是由NCBI比對結果所得，相似度超過97%。MIC單位為μg·mL-1。

Note: The species of the strain was obtained through NCBI comparison, and the similarity was over 97%. The unit of MIC is μg·mL-1.

3 討論(Discussion)

目前，對于空氣中耐藥基因及耐藥菌的研究主要涉及動物飼養場、污水處理廠、醫院、農貿市場及室外等。對一些相對封閉環境中的空氣研究較少。本文通過對機艙空氣過濾網HEPA上細菌的耐藥性進行分析，來揭示機艙空氣環境中耐藥基因的傳播風險。Ⅰ類整合子在耐藥基因的水平轉移過程中起重要作用，樣品中intI1的相對含量為3.94×10-1，比美國科羅拉多州的豬場高了將近300倍，比奶牛場高了將近100倍[25]。高濃度的Ⅰ類整合子暗示著機艙環境內的耐藥基因有著向其他細菌進行水平轉移的風險。HEPA中分離出的細菌有很多都是條件致病菌，比如陰溝腸桿菌和蠟樣芽胞桿菌等，而Zhou等[20]也在中國北方三大城市樣品中分離得到這2種條件致病菌。此外，本研究發現有78.1%的細菌對磺胺甲惡唑耐藥，這比金明蘭等[26]從養殖場空氣中分離出的360株大腸桿菌對磺胺甲惡唑的耐藥比例(73.6%)還高。幾乎所有的腸桿菌屬都對磺胺甲惡唑、慶大霉素、氨芐西林和亞胺培南具有耐受性；10株微球菌中9株都對慶大霉素和亞胺培南敏感；在所有細菌中，只有4株芽孢桿菌對四環素具有耐藥性；81%的芽孢桿菌對亞胺培南敏感。以上結果表明，機艙環境是耐藥基因傳播的高風險環境，對于此類環境介導的耐藥基因傳播特征需要更多的關注。