拓展等效線圖法評估離子液體與殺菌劑多果定之間的拮抗作用

張瑾，姜慧，董欣琦，卞志強

1. 安徽建筑大學環境與能源工程學院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥 230601 2. 清華大學新興有機污染物控制北京市重點實驗室，北京 100084

化學品污染已引起了嚴重的環境問題。混合物是污染物在環境中存在的普遍規律，混合物產生的累積毒性與相互作用對環境中暴露的生物具有潛在的風險。因而，化學混合污染物毒性評估與預測是環境化學領域研究的熱點[1-2]。等效線圖法是一種經典的二元混合物聯合毒性作用的圖形分析方法，可以直觀地反映觀測值是否偏離預測模型[3-5]。但經典等效線圖法只能分析化學混合物在某個特殊效應水平下(通常為半數效應濃度EC50)的相互作用[6-7]，如王成林等[8]應用等效線圖法分析3種咪唑類離子液體和殺菌劑甲霜靈(MET)在半數效應濃度(EC50)水平時的毒性相互作用，發現二元混合物體系的相互作用(協同作用或拮抗作用)隨MET濃度比的變化而變化。

然而，在實際的環境體系中，大多數毒物及其混合物的濃度往往遠低于50%效應的濃度[9]。因此，經典等效線圖法在實際應用中受到了限制，需要將等效線圖法進行拓展，以適于包括高、低效應水平在內的多個效應水平下的混合物毒性相互作用評估。Zhang等[10]在評估離子液體和農藥間相互作用研究中，將等效線圖法進行了拓展，并應用于評估多個效應水平下預測混合毒物的相互作用，結果發現混合物在多個效應水平下表現出不同的作用類型。

離子液體(ionic liquids, ILs)是一種所謂的“綠色”有機溶劑[11]，根據其結構可分為咪唑類和吡啶類ILs。近年來，因其具有在常溫下蒸氣壓低、不易燃等優良特性，尤其是不揮發的特性，減少了對空氣的污染，因而被廣泛應用于合成、催化和提取等化工領域中[12-15]。然而，正是其廣泛的應用和很高的水溶性，進入環境后，ILs很可能會對水體中生物的生存構成很大的威脅[16]。同時，污染物并不僅僅以其自身原本的形式和濃度存在，在進入環境中后，會與其他污染物如農藥等結合成各種形式和濃度的混合污染物，進而對環境中的生物甚至人類的生存和健康構成更大的風險[17-18]。目前已有大量文獻報道ILs尤其是咪唑類ILs與其他污染物共存時對水生生物產生很強的聯合毒性，而關于吡啶類ILs的研究報道較少。

因此，本文基于吡啶環上烷基鏈的分子結構設計特點，以3種具有不同烷基鏈長的溴代吡啶離子液體：溴化丁基吡啶([bpy]Br)、溴化己基吡啶([hpy]Br)、溴化辛基吡啶([opy]Br)和殺菌劑多果定(Dod)為研究對象，應用直接均分射線法設計離子液體與農藥多果定的二元混合物體系，并應用拓展等效線圖法分析在5個不同的效應水平(ECx)下的混合物體系的毒性相互作用情況，與經典等效線圖法和濃度加和(concentration addition, CA)模型評估的結果進行比較，研究結果將為化學混合物毒性相互作用評估提供方法和數據參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗儀器與材料

BioRad酶標儀(美國Bio-Rad公司)、MGC-250型智能型光照培養箱(上海一恒科技有限公司)、BT25S型五位電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)、70SW-CJ-IF超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司)、Dragon-lab單道可調移液器(10～100 μL)、手動12道移液器(大龍興創實驗儀器有限公司)(50～300 μL)和Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)。

[bpy]Br、[hpy]Br和[opy]Br購自德國Merck公司，多果定(Dod)購自德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司，4種試劑均為優級純試劑，其結構式見圖1，其CAS登記號、分子式和分子量等參數見表1。實驗前均用Milli-Q超純水配制儲備液并保存在棕色瓶中，置于4C冰箱保存待用。

圖1 4種化學物質的結構式注：Dod表示多果定，[bpy]Br、[hpy]Br和[opy]Br表示 溴化丁基吡啶、溴化己基吡啶和溴化辛基吡啶。Fig. 1 The structures of four chemicals Note: Dod stands for dodine; [bpy]Br, [hpy]Br and [opy]Br stand for bromide butyl pyrimidine, bromide hexyl pyrimidine and bromide oxyl pyrimidine.

1.2 菌種的培養和毒性測試

青海弧菌(Vibrioqinhaiensissp.-Q67, Q67)購自北京濱松光子技術股份有限公司，液體培養基配方及菌種培養方法參見文獻[19]，Q67活化和接種方法見文獻[20]。

采用微板毒性分析法(microplate toxicity analysis, MTA)測定每個化學毒物以及它們的混合物體系對Q67的發光抑制毒性[21-22]。每個組分及其混合物射線均設計12個濃度梯度、3個平行，同時設24個空白對照，并重復3板。每孔試液總體積200 μL，其中菌液100 μL。在酶標儀上測定各試液的相對發光單位(RLU)，依據空白RLU的平均值(I0)和各濃度梯度3次測量RLU的平均值(I)，計算出毒物及其混合物體系各濃度梯度的發光抑制率E：

(1)

1.3 二元混合物設計

為了合理地探索整個濃度空間范圍下二元混合物的毒性變化規律，采用直線均分射線法(direct equipartition ray design, EquRay)[23]設計3個ILs與農藥Dod的3組二元混合物體系(Dod-[bpy]Br、Dod-[hpy]Br、Dod-[opy]Br)，每組混合物體系安排5條射線(R1、R2、R3、R4和R5)。每條射線代表具有一定濃度配比(pi,i=Dod、ILs)的二元混合物射線，實驗中每條射線安排12個濃度點。EquRay設計的3組二元混合物體系的構成及其濃度配比見表2。

1.4 濃度效應擬合

應用MTA法獲得的離子液體和多果定以及它們的二元混合物體系對Q67的濃度-效應數據，采用Weibull和Logit函數進行最小二乘擬合，Weibull和Logit如式(2)和(3)所示：

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(2)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(3)

式中α和β分別為位置參數和斜率參數，c為毒物濃度。

表1 3種離子液體和農藥多果定的基本性質、擬合函數及其統計量、半數效應濃度及其負對數Table 1 Physicochemical properties, fitted functions together with some statistics, the median effective concentration as well as their negative logrithm of three ionic liquids (ILs) and pesticide dozine

注：α和β是擬合參數，r和RMSE分別表示相關系數和均方根誤差。

Note:αandβare two parameters;rand RMSE stand for correlation coefficient and root-mean square error, respectively.

1.5 濃度加和模型

選擇標準加和模型CA為參考模型，比較觀測毒性與CA模型預測毒性的大小：如果觀測毒性大于、等于或小于CA模型預測毒性，則認為混合物發生了協同作用、加和作用或拮抗作用。CA模型公式表達為[24-25]：

(4)

式中：ci表示混合物效應為x時該混合物中第i個組分的濃度；ECx,i為第i個組分的等效應濃度；n是混合物中組分數。

1.6 等效線圖法與拓展等效線圖法

等效線圖法[26-27]是用來評估二元混合物相互作用的圖形分析法，在平面直角坐標系內展現二元混合物在某個特殊效應(50%)時混合物毒性相互作用情況。在傳統的等效線圖中，僅連接直角坐標系二元混合物組分EC50值點，構造截距，稱為CA預測線。根據CA預測線位于觀測值的置信區間內、上方或下方，表示二元混合物為加和效應還是非加和效應。如果CA預測線在觀測值的置信區間內、上方或下方，則分別稱混合物呈加和作用、拮抗作用或協同作用。拓展的等效線圖法，不僅連接直角坐標系二元混合物組分EC50值點，同時連接多個ECx值點，實現了在多個效應水平下評估二元混合物的毒性相互作用。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 3種ILs和多果定對Q67的毒性

通過MTA法測得的3種溴代吡啶ILs和農藥Dod在12 h對Q67的濃度-效應數據及Weibull函數和Logit函數擬合結果列于表1中，實驗觀測的濃度-效應數據及其擬合的濃度-效應曲線(CRCs)見圖2。表1顯示，Weibull函數和Logit函數都能較好地表征4種化合物的濃度-效應數據(r≥0.9971, RMSE≤0.036)。以半數效應濃度的負對數(-lgEC50即pEC50)作為毒性指標，4種毒物對Q67的毒性順序為Dod>[opy]Br>[hpy]Br>[bpy]Br。Dod的毒性大于離子液體的毒性，同時3種離子液體對Q67的毒性都具有烷基鏈效應[28]，即其毒性隨烷基鏈上碳原子數的增加而增加，則ILs的pEC50值幾乎增加1，文獻也報道了類似的結果[29-30]。從化學物的作用機制分析，多果定屬于胍類殺菌劑，溶于水后會帶正電荷，吸附于帶負電荷的微生物表面，并滲透到微生物體內，聚合形成的薄膜堵塞微生物呼吸道通道，使微生物迅速窒息死亡[31]。發光菌Q67作為直接靶細菌，被多果定迅速鎖定并殺死。這可能是多果定的毒性大于其他3種離子液體的原因。

圖2 3種離子液體和多果定的濃度-效應曲線(CRCs)注：圖中分散的點表示實驗觀測值，實線表示擬合線。Fig. 2 The concentration-response curves of three ionic liquids and dodine Note: The scattered points and solid lines in diagram represent the observed values and fitted lines, respectively.

圖2顯示4種化學物質對Q67的CRCs曲線呈經典的S形，相互之間幾乎是平行的，表明4種化學物質對Q67的毒性響應隨濃度變化的規律相似。

2.2 Dod-ILs混合物體系對Q67的毒性

3組多果定與ILs的二元混合物體系(Dod-[bpy]Br, Dod-[hpy]Br, Dod-[opy]Br)共15條射線對Q67的濃度-效應數據擬合結果見表2，擬合的15條射線的CRC曲線以及實驗觀測值繪于圖3中。從表2中可看出Weibull函數和Logit函數能有效擬合3組多果定與ILs二元混合物的濃度-效應關系(r>0.9815, RMSE<0.068)。以pEC50作為毒性指標，結合表2中混合物組分的濃度配比pi值，可看出，隨著混合物組分中pDod值的減小，3組二元混合物體系(R1～R5)的15條射線的pEC50值也隨之逐漸降低，即各組二元混合物的毒性逐漸減小。且兩者呈良好的線性關系，3組二元混合物體系的pEC50值與pDod的線性擬合關系方程如下：

Dod-[bpy]Br pEC50=111.21×pDod+2.2

(r=0.9774)

(5)

Dod-[hpy]Br pEC50=17.95×pDod+3.14

(r=0.9729)

(6)

Dod-[opy]Br pEC50=1.02×pDod+4.33

(r=0.7503)

(7)

表2 3組二元混合物的構成、組分濃度配比(pi)、擬合函數及其統計量、半數效應濃度及其負對數Table 2 The composites, concentration ratios (pi), fitted functions together with some statistics, the median effective concentration as well as their negative logrithm of three binary mixture rays

注：pDod和pILs表示多果定和離子液體的濃度比，L和W分別為Logit和Weibull。

Note:pDodandpILsstand for the concentration ratios of dodine and ionic liquids; L and W represent for Logit and Weibull, respectively.

從方程(5)～(7)可看出，混合物體系Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br的pEC50值與Dod的濃度比有很好的正相關性(r>0.97)，在混合物體系Dod-[opy]Br中，其pEC50值與Dod的濃度比的相關性稍差，可能是由于[opy]Br的毒性與Dod的毒性較接近的緣故[21,30,32]。

2.3 CA模型對Dod-ILs混合物體系的拮抗作用表征

CA模型能較好地評估大多數混合物的毒性[22,33-35]。本研究中，CA模型對于3組二元混合物體系中所有15條射線的毒性效應的評估預測結果也繪于圖3中。從圖3中可知，15條混合物射線的CA預測線均高于實驗觀測值，說明15條射線均為拮抗作用，但CA預測線偏離每條混合物射線的程度不同，即拮抗作用程度不同，這可能與混合物體系中各射線組分及其濃度配比的不同有關[36]，如Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br體系中射線的拮抗作用隨組分濃度配比pDod的減少先逐漸增強然后逐漸減弱，而在Dod-[opy]Br體系中5條射線的拮抗作用隨pDod的增加沒有明顯變化，可能是由于在Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br體系中，農藥Dod的濃度配比pDod較小，而其毒性遠大于2個ILs，而在Dod-[opy]Br體系中，2個組分的毒性較接近[37-39]。

2.4 等效線圖法對Dod-ILs混合物體系的拮抗作用表征

圖4是等效線圖法對Dod-ILs混合物體系15條射線在50%濃度-效應水平時的毒性相互作用的表征結果。從圖4中可知，15條射線的等效線圖均位于CA預測線的上方，這說明在EC50效應水平下，混合物間均存在拮抗作用。

2.5 拓展等效線圖法評價混合物毒性效應

圖5是Dod與ILs的3組二元混合物體系在5個不同效應濃度(EC20、EC30、EC40、EC50和EC60)水平下的等效線圖。從圖5可知，3組混合物在5個效應水平線下的等效線均位于對應的CA預測線上方的拮抗區域，且不對稱。同一混合物體系中，5條射線在同一濃度效應水平拮抗作用程度不同，在Dod-[hpy]Br體系中，R4的拮抗作用比其他4條射線的拮抗作用明顯，而其他2個混合物體系的R4沒有呈現出明顯的變化。與圖3相比，CA模型預測需要一個混合物體系的所有射線的CA線、觀測值等必須逐一畫出，比較麻煩，尤其是在同一個圖內不容易展示，更不容易觀察和比較相互作用情況。而拓展等效線圖法不僅能表現出一組混合物體系中全部射線的相互作用類型，且能直觀地分析比較出各射線毒性相互作用的變化情況，簡化了混合物毒性相互作用比較分析的過程。與圖4相比，拓展等效線圖法不僅分析了EC50水平時毒性相互作用情況，也分析了其他效應水平，即拓寬了三組混合物體系拮抗作用評價的效應水平范圍，且與濃度加和(CA)模型評估結果相似。因此，拓展后的等效線圖法可以用于化學混合污染物實際環境的毒性評價。

圖3 3組二元混合物體系的濃度-效應曲線及其濃度加和模型(CA)預測值注：●實驗值；—擬合線；﹍CA預測線。Fig. 3 The concentration-response curves and predicted lines by concentration addition (CA) for three binary mixture systems Note: ● observed data; — fitted line; ﹍ predicted line by CA.

圖4 3組二元混合物體系的等效線圖注：圓圈及連接的線段為各射線等效點及95%觀測置信區間；實曲線為擬合等效線；實直線為CA預測線。Fig. 4 Isobolograms for three binary mixture systems Note: circle and connected line segment represents equal toxicity point of each ray and 95% observation confidence interval; solid curve represents fitted equal toxicity line; solid line represents CA prediction line.

圖5 3組二元混合物在5個不同效應水平的拓展等效線圖注：R1、R2、R3、R4、R5為混合物混合射線；彩色實曲線為擬合等效線；彩色實直線為CA預測線。Fig. 5 Extended isobolograms at five effect concentration levels (EC20, EC30, EC40, EC50 and EC60) for three binary mixtures Note: R1, R2, R3, R4, R5 represents mixture ray; color solid curve represents fitted equal toxicity line; color solid line represents CA prediction line.

綜上所述：(1)具有不同烷基鏈的3種吡啶類離子液體(ILS)對發光菌Q67的發光抑制毒性具有典型的烷基鏈效應，且4種毒物對Q67的毒性大小順序為Dod>[opy]Br>[hpy]Br>[bpy]Br。

(2)3組二元混合物體系均呈明顯的拮抗作用，且混合物射線毒性與Dod組分濃度具有一定的線性關系。

(3)拓展等效線圖法能較好、直觀地表征3組二元混合物體系的拮抗作用，與傳統等效線圖法相比，拓寬了評估混合物效應濃度水平的范圍；與CA模型評估結果相似，不僅直觀且簡化了混合物毒性相互作用分析過程。