外泌體在乳腺癌中的研究進展

陳 芳，馬方婧，迪麗米娜·伊拉木，趙培吉，郭麗英

(新疆醫科大學第一附屬醫院乳腺外科，烏魯木齊 830054)

乳腺癌嚴重危害著女性的生命和健康，是全球婦女中最常見的惡性腫瘤之一。部分女性死于這種疾病，主要原因為腫瘤的早期轉移、藥物耐藥、腫瘤復發等。因此，乳腺癌的早期診斷對改善患者無復發生存率和提高無病生存率至關重要。全數字化X線乳腺鉬靶、超聲、磁共振成像等影像學檢查廣泛應用于乳腺癌的篩查，但其因腫瘤的最小可檢出尺寸和部分患者的低輻射而應用受限[1]。血清腫瘤標志物、分子生物標志物由于特異性差和低敏感性，不能及時篩選出早期乳腺癌患者外周血中的腫瘤細胞。而液體活檢所提取的外泌體因低成本和無創的取樣方法在早期檢測、篩選和研究腫瘤動態及復發風險中被廣泛應用[2]。外泌體由所有活細胞分泌，是一種直徑為30～150 nm的細胞外囊泡[3]。外泌體包含其起源細胞的遺傳信息，一旦釋放，在循環系統中均勻穩定的存在，這種獨特的性質使外泌體成為乳腺癌早期診斷、預后監測的一類最有意義的新型標志物[3]。其攜帶的生物活性分子包括促凋亡蛋白-2B[4]、miR-221/222[5]等。現就外泌體在乳腺癌診斷、轉移、治療、耐藥中的研究進展予以綜述。

1 外泌體概述

1.1外泌體的生物發生 晚期內體膜向內出芽，產生被膜覆蓋的稱為多泡體的小泡。多泡體的直徑為 250～1 000 nm，內含幾個直徑為30～100 nm的腔內小泡。腔內小泡由多泡體的內體膜形成，其通過在膜上分離內容物然后向內內陷，并將含有一部分胞質溶膠的膜囊泡釋放到多泡體的腔內空間。在內體成熟期間形成的這些多泡體中的一些被引導至溶酶體途徑以進行降解，而部分多泡體與質膜融合導致腔內小泡的釋放。釋放到細胞外環境中的腔內小泡被稱為外泌體[6]。外泌體廣泛存在于生理或病理液體中，包括血漿、滑膜液、唾液、痰液、腦脊液、淋巴液和腹水[3]。

1.2外泌體的生物功能 根據外泌體的形成和分泌機制，外泌體的形態是不均勻的，其攜帶大量的生物活性分子，這些分子通常反映了外泌體起源細胞的內容。而外泌體攜帶的大量生物活性分子(miRNA、蛋白質)水平代表了其起源細胞的表型,外泌體被細胞的磷脂雙分子層所包圍，其包含了幾乎所有的分子，包括蛋白質、核酸和脂質[7]。外泌體通過將特定的分子轉移到受體細胞而發揮一系列的生物學作用[8]。其生物學功能包括抗原的表達、參與免疫調節、免疫監視的逃避、逃避細胞凋亡、耐藥等[9]。外泌體是腫瘤微環境的組成部分[10]，其通過與受體細胞細胞膜的直接融合，或受體細胞吞噬外泌體后再與細胞膜的間接融合，或與受體細胞表面的特異性受體結合后釋放其攜帶的內容物[11]，導致受體細胞的遺傳信息交換和代謝重組，并在腫瘤微環境中介導細胞間通信，參與組織浸潤、轉移和血管生成，最終導致腫瘤微環境惡化[12]，進而促進受體細胞的增殖、侵襲和轉移，并轉移耐藥性，從而促進腫瘤復發及轉移[13]。

2 外泌體miRNA、蛋白質在乳腺癌診斷中的作用

外泌體及其內容物作為細胞間信息交流的重要載體，參與腫瘤增殖、播散、浸潤等過程的調控，可作為癌癥診斷或預后的標志物。外泌體miRNA是診斷乳腺癌的生物標志物，Hannafon等[14]發現miR-21和miR-1246水平在乳腺癌患者中明顯升高。他們的結果支持了外泌體miRNA可作為乳腺癌重要診斷工具的觀點。此外，基質金屬蛋白酶10、熱激蛋白90、膜聯蛋白-1在乳腺癌患者血清或胸腔積液的外泌體中特異性表達[15]。Moon等[16-17]證明，血漿中檢測到的含有發育內皮基因座-1和纖維連接蛋白的外泌體可作為早期診斷乳腺癌的生物標志物，且發育內皮基因座-1是一個可以用來區分乳腺癌與乳腺良性腫瘤和非癌性疾病的有用標志物。

3 外泌體參與乳腺癌的侵襲和轉移

侵襲和轉移是惡性腫瘤的特征。侵襲和轉移是一個復雜、多步驟的過程，而每個步驟都涉及腫瘤細胞與圍繞腫瘤的正常細胞之間的“串擾”，這些囊泡在細胞之間轉移信使RNA、miRNA和蛋白質等分子[18]，誘導相應的信號通路活化從而影響組織侵襲、轉移。

3.1外泌體形成及內容物的異常 外泌體在形成、分泌內容物的過程中出錯會促進乳腺癌的轉移。研究發現，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶[19]表達減少或該酶的藥理學抑制使編碼溶酶體液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)質子泵(ATP6V1A)A亞基的mRNA不穩定，導致其表達減少。 ATP6V1A水平的降低削弱了溶酶體降解活性并導致多泡體增大，然后多泡體與質膜融合并釋放含有不同載體的外泌體，并強烈促進細胞存活和遷移。該研究進一步證明了在減少煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶表達后，組織蛋白酶的分泌顯著增加，其降解細胞外基質，允許腫瘤細胞侵入周圍組織，促進乳腺癌的轉移。同時，外泌體內組分miRNA和蛋白質也參與乳腺癌的轉移。Zhou等[20]發現，外泌體介導了miR-105的轉移，因miR-105減少了緊密連接蛋白的表達，破壞細胞與細胞的緊密連接，導致天然屏障被破壞，從而誘導細胞轉移。Maji等[21]發現，乳腺癌細胞來源的外泌體中的膜聯蛋白A2是作為乳腺癌細胞腦和肺特異性轉移的介質，其通過引起巨噬細胞介導的p38促分裂原活化的蛋白激酶、核因子κB和信號轉導及轉錄激活因子3通路活化，促進白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的分泌。

3.2介導免疫抑制 在免疫系統方面，外泌體可以介導免疫抑制，從而促進腫瘤的侵襲和轉移。腫瘤細胞釋放的外泌體可通過抑制樹突狀細胞分化和成熟障礙，降低自然殺傷細胞的細胞毒性，誘導巨噬細胞極化，抑制細胞毒性T淋巴細胞反應的損傷和誘導調節性T細胞[分泌免疫抑制細胞因子(白細胞介素-10、轉化生長因子-β1)]的產生以及調控B細胞的活化來幫助癌細胞逃避免疫攻擊[22]。Piao等[23]證實，乳腺癌細胞來源的外泌體的增殖可通過刺激巨噬細胞極化為淋巴結的轉移創造有利條件。Okoye等[24]發現，調節性T細胞可以通過外泌體傳遞miRNA來抑制效應T細胞，調節性T細胞來源的外泌體含有成熟和未成熟的miRNA，尤其是具有促凋亡或抗增殖功能的miRNA，這些miRNA可以抑制環氧合酶基因，從而限制輔助性T細胞1相關反應。

3.3改變腫瘤微環境 腫瘤微環境常被比作腫瘤細胞生長的土壤。其是指圍繞腫瘤細胞的各種正常細胞、信號分子、血管和細胞外基質[9]。外泌體由原發腫瘤分泌并通過循環傳遞，其可誘導遠處器官轉移前生態位的形成，為腫瘤細胞提供營養物質，同時外泌體能促進原發腫瘤的生存和生長。研究發現，乳腺癌細胞外泌體中的蛋白質可以促進器官特異性轉移和血管生成[25]。脂肪細胞作為腫瘤微環境中的一部分參與乳腺癌的轉移。另有研究發現，間充質干細胞分化的脂肪細胞外泌體通過激活Hippo信號通路，影響腫瘤發展的相關基因，進而促進乳腺癌細胞的增殖和遷移[26]。氧氣對于細胞的生理活動十分重要。文獻報道，暴露于低氧環境下的癌細胞增加了外泌體的產生，這些外泌體通過與受體細胞接觸來刺激癌細胞的侵襲和轉移[27]。

4 外泌體在乳腺癌治療中的應用

4.1作為納米載體用于乳腺癌的治療 乳腺癌化療及內分泌藥物治療對健康組織的不良反應，使乳腺癌的治療更加困難。外泌體具有較高的血清穩定性、毒性低、易通過各種屏障、較高的生物相容性和較低的免疫原性，基于以上特性，外泌體具有作為納米載體傳遞藥物的潛力，可用于乳腺癌的治療[28]。多柔比星的心臟毒性使乳腺癌患者的化療藥物劑量受到限制。Hadla等[29]證明，與游離藥物相比，多柔比星包裹的外泌體降低了心臟毒性和減少了對其他組織的不良反應，因此多柔比星的劑量可以增加，從而靶向增加了對乳腺癌細胞的細胞毒性作用。乳腺癌轉移到局部淋巴結和遠處器官是乳腺癌高死亡率的主要原因。一項研究發現，用巨噬細胞來源的外泌體組成的納米平臺在受到生物激發后，可以優先在原位和肺轉移的腫瘤細胞聚集，快速內化到腫瘤細胞中，分解并釋放其活性藥物核心，從而觸發凋亡信號，抑制細胞增殖，其可用于乳腺癌肺轉移的患者[30]。

4.3參與乳腺癌的免疫治療 腫瘤對免疫系統的逃逸，使腫瘤的治療更加困難，因此使用基于外泌體激活免疫應答成為一種新的癌癥治療策略。Wang等[34]用腺病毒載體轉染樹突狀細胞的外泌體制成疫苗，該疫苗刺激了細胞毒性T淋巴細胞的反應，并觀察到可殺死癌細胞和根除腫瘤。Cheng等[35]設計了一種新外泌體，即合成多價抗體重定向外泌體，該外泌體可以同時靶向T細胞表面CD3和腫瘤細胞表皮生長因子受體，可誘導表皮生長因子受體陽性細胞在非活化狀態下被外周血單個核細胞高效、特異性殺傷，進而發揮良好的抗腫瘤作用。有研究發現，腫瘤源性外泌體攜帶腫瘤抗原，其可觸發抗原呈遞細胞的高效抗原呈遞，可作為腫瘤抗原的來源制備腫瘤疫苗激活免疫系統，進而促進抗腫瘤反應[22]。

5 外泌體參與乳腺癌的耐藥

目前，乳腺癌術后化療及內分泌藥物在其治療中占重要地位，但仍有部分患者出現耐藥，阻礙其治療。外泌體通過參與耐藥機制的形成、改變腫瘤微環境、轉移內容物等參與乳腺癌的耐藥。

5.1耐藥機制形成 P-糖蛋白存在于外泌體中，其通過泵出藥物維持細胞水平超過有效濃度而導致耐藥。有文獻報道，外泌體介導的細胞-細胞轉移P-糖蛋白是外泌體促進乳腺癌細胞耐多西紫杉醇的主要機制[36]。瞬時受體電位通道5可以刺激P-糖蛋白的形成，若瞬時受體電位通道5在外泌體中聚集，則可以增加外泌體捕獲P-糖蛋白，從而使乳腺癌細胞對阿霉素耐藥[37]。Matula等[38]研究顯示，上調瞬時受體電位通道5在受體細胞中的表達，可通過激活T細胞亞型c3介導的鈣離子和轉錄因子核因子來增加藥物外排P-糖蛋白的量，從而導致乳腺癌細胞耐藥。Chen等[39]的研究表明，乳腺癌細胞分泌的外泌體miR-451可與多耐藥基因1結合，下調P-糖蛋白的表達，進而導致乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性降低，治療效果較差。

5.2改變腫瘤微環境 腫瘤微環境參與乳腺癌的耐藥。腫瘤相關成纖維細胞通過旁分泌外泌體增強腫瘤干細胞的自我更新能力，并上調腫瘤干細胞中ABCB5(ABC轉運蛋白家族中的一員，與乳腺癌的化療耐藥有關)的表達促進其對化療藥物的抵抗，進而誘導乳腺癌化療耐藥[40]。Boelens等[41]發現，Rab27b蛋白的上調導致基質細胞外泌體的過度釋放，這些外泌體誘導鄰近乳腺癌細胞中的信號轉導及轉錄激活因子1蛋白并激活Notch3信號通路，導致乳腺癌細胞化療耐藥和對放療的敏感性降低。Yang等[42]證明了阿霉素耐藥的乳腺癌細胞分泌攜帶泛素羧基末端水解酶-1和P-糖蛋白的外泌體進入細胞外微環境，然后以時間依賴的方式整合到對阿霉素敏感的乳腺癌細胞中，從而轉移耐藥性。

5.3轉移miRNA 外泌體通過將特定的miRNA轉移到敏感的受體細胞中，從而發揮耐藥作用。外泌體在結合、吸收和內化后，可通過調節基因表達、信號通路、細胞周期分布和藥物誘導的凋亡來改變受體敏感細胞的易感性[43]。其中，miR-221/222參與三苯氧胺耐藥，受體細胞中miR-221/222水平的升高減少了細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27和雌激素受體α的靶基因表達，導致細胞周期失調和他莫昔芬耐藥[5]。miR-222、miR-100和miR-30a參與阿霉素的耐藥，受體細胞中上述miRNA水平的升高，導致乳腺癌細胞轉錄水平的改變和阿霉素耐藥[44]。靶基因預測和通路分析研究結果顯示，在治療失敗的通路中，多西他賽耐藥乳腺癌細胞的外泌體中含有20個豐富的miRNA，這些含有miRNA的外泌體能夠下調敏感細胞中的miR-23a、miR-222和miR-452，參與多西他賽的耐藥[45]。

6 小 結

外泌體及其內容物可用于乳腺癌的早期診斷，且特異性和敏感性優于傳統的生物標志物，其各種作用也被廣泛研究。一方面，外泌體在乳腺癌細胞中有抑制增殖和提高化療反應的作用，經過處理的的外泌體特異性靶向乳腺癌細胞，提高化療效果及延長藥物的半衰期。另一方面，乳腺癌細胞外泌體在正常乳腺細胞中誘導致癌特性，在化療敏感的乳腺癌細胞中誘導對化療和放療的耐藥，且乳腺癌細胞外泌體也參與乳腺癌的侵襲和轉移，其通過激活相應的信號通路，導致非侵襲性乳腺癌細胞的遷移和轉移。然而，外泌體的這些作用機制尚未得到證實。雖然許多候選的外泌體生物標志物被建議用于乳腺癌診斷，但因其分離提取純化的方法較難導致其停留于實驗階段。未來，外泌體由于低免疫原性可作為納米載體的特性，將成為免疫治療、基因治療乳腺癌的新方向。