噬菌體在環境耐藥基因轉移中的作用綜述

曾祥朋 楊清香

摘要：耐藥細菌隨著畜禽糞便排出體外后，其攜帶的耐藥基因可以通過質粒、轉座子、整合子等可移動元件傳遞給其他環境微生物，從而導致耐藥基因的傳播和擴散。目前對耐藥基因轉移機制的研究多集中在質粒、轉座子、整合子等，對噬菌體在耐藥基因傳播中的貢獻了解甚少。在河流、海洋、污水等自然環境中通過噬菌體轉導機制進行基因轉移已經被證實，噬菌體作為可移動元件在基因轉移和基因重組中的作用頻率比人們預想的要高。為了能正確認識噬菌體在畜禽糞便抗生素耐藥基因水平傳播中的作用，結合國內外相關研究，介紹環境噬菌體的特性及其生態分布、環境噬菌體攜帶耐藥基因情況、噬菌體介導的基因轉移機制以及噬菌體在抗生素耐藥基因傳播中的作用，以期為了解環境噬菌體在耐藥基因水平轉移中的作用提供參考。

關鍵詞：抗生素耐藥基因;基因水平轉移;噬菌體;轉導;介導;基因轉移機制

中圖分類號： X172 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0014-05

近幾十年來，為了提高畜禽生長速度，抗生素在畜禽養殖業中被大量應用。報道顯示，我國抗生素年產量約2萬t，46.1%用于畜禽養殖業，其中近一半用于動物生長促進劑[1]。抗生素的使用改變了養殖動物腸道微生物的耐藥特性，同時也促進了腸道微生物耐藥性的進化。Looft等對生豬飼料同時添加100 g/t金霉素、100 g/t磺胺甲嘧啶、50 g/t青霉素，隨著時間的延長豬的腸道微生物群落結構發生變化，所施加抗生素的耐藥基因豐度也有所增加[2]。Zhu等的研究表明，動物飼料和治療用藥使得63種耐藥基因富集了192～28 000倍[3]。長期使用抗生素而形成的選擇壓力，使得耐藥細菌逐漸被篩選出，隨著糞便排出體外[4]。目前，畜禽糞便已經成為自然環境中耐藥細菌和耐藥基因的儲存庫[5]。耐藥基因是細菌表現耐藥性的根本原因，耐藥細菌隨著畜禽糞便排出體外后，其攜帶的耐藥基因可以通過質粒、轉座子、整合子等可移動元件傳遞給其他環境微生物，從而導致耐藥基因的傳播和擴散[6]。因此，當含有耐藥細菌和耐藥基因的糞便進入自然環境后，在高豐度耐藥基因、可移動元件及其他環境壓力共存的情況下，環境中的敏感細菌可能會因此產生抗生素耐藥性，若人類致病菌通過這種方式獲得多重耐藥性，則會對人類健康造成巨大危害[7]。

目前，關于畜禽糞便中耐藥細菌和耐藥基因的污染問題已經得到廣泛關注，但是對其耐藥基因轉移機制的研究多集中在質粒、轉座子、整合子等，對噬菌體在耐藥基因傳播中的貢獻了解甚少[8-9]。近年來噬菌體在河流、海洋、污水等自然環境中通過轉導進行基因轉移已經被證實[10]，噬菌體作為可移動元件在基因轉移和基因重組中的作用頻率比人們預想的要高[11-12]。

本文將總結近些年環境噬菌體研究的重要進展，介紹環境噬菌體的特性及其生態分布、環境噬菌體攜帶耐藥基因情況、噬菌體介導的基因轉移機制以及噬菌體在抗生素耐藥基因傳播中的研究方法，以期為全面了解環境噬菌體在耐藥基因水平轉移中的作用提供參考。

1 環境噬菌體的特性及其生態分布

噬菌體是原核微生物病毒。噬菌體基因組由單鏈或雙鏈的DNA或RNA組成，大小從幾個kb到100 kb不等。根據對宿主菌作用效果不同，將噬菌體分為兩大類，即溫和噬菌體和烈性噬菌體。

噬菌體是生物圈中豐度最高的生物體，據估計總體數量可達1030～1032個。在對海洋、淡水和土壤環境中的噬菌體生態研究表明，噬菌體是自然界微生物系統的重要組分，平均每個細菌細胞約有10個噬菌體[12]。噬菌體在海洋中的數量極其豐富，豐度高達1030個，表層海水中噬菌體豐度約為 107個/mL，是細菌數量的5～25倍[14]。人和動物體內也有高濃度的噬菌體，主要存在于腸道中，它們被認為是動物體內最重要的生物群落[15]。由于噬菌體在水和陸地生態系統中具有極高的豐度和變化性，因此可以通過特異性侵染、基因水平轉移、溶源轉換等方式影響細菌群落，并且在有機物質釋放、營養循環和水生態系統的功能等方面起著重要作用[16]。噬菌體對微生物群落構成的強大的捕食壓力意味著細菌能否好好生存不僅取決于可利用的資源，而且取決于生物環境。因此，噬菌體能夠不斷地調節微生物生態和活性，包括營養流食物網動力學、微生物多樣性及多樣化趨勢[17]。

噬菌體在污水處理系統中也普遍存在。研究表明，活性污泥中噬菌體的數量為108～109個/mL，該數量與大多數其他水生態系統相比較高或相當。由于噬菌體對其宿主菌具有特異性的侵染和裂解作用，因此，人們利用噬菌體控制污泥產生以達到污泥減量的目的。Hao等將活性污泥2D號模型進一步發展并研究了污水處理系統中原生動物的捕食和噬菌體的侵染對污泥減量的貢獻，結果表明，捕食作用在污泥減量控制方面更有效，捕食和噬菌體的侵染對污泥減量最大貢獻率分別達21%、9%[18]。

一般來說噬菌體有宿主專一性，1株噬菌體只能侵染1個宿主。但是環境中也存在一些噬菌體不僅能侵染同種不同株的細菌，還能夠侵染分類群完全不同的細菌，甚至能夠侵染革蘭氏染色完全不同的細菌類群，例如，Khan等從活性污泥中分離出8株噬菌體，其中6株均為寬宿主噬菌體，這就使噬菌體-細菌的相互作用關系更加復雜[19]。一方面噬菌體通過轉導可以傳遞相關基因給宿主菌并有利于宿主菌的生存，另一方面噬菌體侵染并裂解細菌，使宿主菌產生對噬菌體的抗性，噬菌體-細菌可以說是在對抗中共進化[20]。環境中數量如此巨大的噬菌體到底有什么作用，在細菌群落發展和演化中起什么作用，目前并不清楚，因此，有關噬菌體和細菌群落的相互關系研究是目前微生物生態學的重要課題。而耐藥細菌群落在環境中的發展和演化是噬菌體群落研究的很好對象，因此有關噬菌體在耐藥轉移中的作用研究逐漸成為該領域的熱點。

2 噬菌體介導基因轉移機制

噬菌體介導細菌間基因轉移的方式為特異性轉導或普遍性轉導。噬菌體在宿主菌體內組裝過程中可能產生2種類型的子代病毒顆粒，一種為只包含病毒DNA的顆粒，一種為誤包進宿主DNA片段的顆粒。誤包有宿主DNA的病毒顆粒感染新的宿主后可將所攜帶的DNA導入受體細胞，通過同源重組形成轉導子，使受體菌獲得新的基因。此種方式可傳遞供體細菌任何基因，由烈性噬菌體或溫和噬菌體介導，稱之為普遍性轉導。噬菌體只能傳遞供體染色體上原噬菌體整合位置附近的基因轉導稱之為特異性轉導，由溫和噬菌體介導。

與轉導相似但本質不同的另一現象為溶原性轉換，當溫和型噬菌體感染宿主細菌時，噬菌體DNA整合到宿主菌染色體上，使其成為溶原性狀態并獲得特有的性狀，如對同源噬菌體的免疫性和可誘導性。通過溶原性轉換還可使宿主菌表型發生改變，獲得或喪失某一性狀。在DNA幾種轉移機制中，由噬菌體引起的溶原性轉變更占優勢，且效率更高[7]。雖然以上幾種轉移機制在自然條件下發生的頻率并不高，但也為基因的轉移提供了一個途徑。

3 環境噬菌體攜帶耐藥基因情況

噬菌體DNA上攜帶耐藥基因已經成為一個不爭的事實，目前，各類水體如城市污水處理廠、活性污泥、河流、醫院廢水、養殖廢水、屠宰場廢水等均被檢測，已檢測到的耐藥基因種類基本涵蓋各種常用抗生素，例如β-內酰胺類、喹諾酮類、四環素類、甲氧西林、磺胺類等，具體見表1。

作為噬菌體儲存庫的土壤環境目前也已被研究。Ross等利用qPCR手段檢測土壤中細菌和噬菌體DNA上所攜帶耐藥基因的情況，共對strA、strB、sul1、aadA、blaOXA-20等5對耐藥基因進行檢測，結果顯示所有的耐藥基因均在選用的樣品中檢出[27]。施用未經處理、厭氧消化處理、脫水處理肥料的土壤中細菌DNA中耐藥基因豐度有所增加，但是施用經堆肥處理的糞便土壤中耐藥基因豐度有所降低，這就表明堆肥處理顯著降低了攜帶耐藥基因細菌的數量，致使檢測結果中耐藥基因豐度降低。但是噬菌體DNA上的耐藥基因豐度在各個土壤樣品中基本持平。這就說明噬菌體作為基因的載體在自然環境中相對其宿主菌來說更加穩定。

除了環境樣品，人體糞便樣品中的噬菌體DNA也被檢測到耐藥基因的存在。Minot等對人類糞便樣品做病毒宏基因組分析，測序結果主要為噬菌體基因組信息[28]。Liu等利用ARDB對測序結果進行耐藥基因分析，在基因組中找到萬古霉素類、四環素類、β-內酰胺類等耐藥基因[29]。除了利用宏基因組對噬菌體基因組進行研究，目前對噬菌體DNA的耐藥基因檢測主要利用的手段為熒光定量PCR（qPCR）。Quirós等研究了80個人類糞便樣品中噬菌體DNA上耐藥基因攜帶情況，80個研究個體在研究期間均未使用抗生素，用qPCR的方法檢測了blaTEM、blaCTX-M-1、mecA、armA、qnrA、qnrS等基因的豐度，結果顯示，77%的樣品中至少被檢測到1種或多種抗生素耐藥基因，其中blaTEM、qnrA、blaCTX-M-1等是豐度最高的耐藥基因[9]。

噬菌體是細菌適應不同環境的一個潛在遺傳基因庫，是細菌維持自身群落穩定的重要因素。Modi等讓小鼠口服環丙沙星和氨芐青霉素，研究在抗生素選擇壓力下噬菌體和細菌如何變化，在抗生素的作用下，噬菌體基因組上編碼大環內酯類和β-內酰胺類耐藥基因增多，同時還出現了與環丙沙星和氨芐青霉素無關的其他耐藥基因;從口服抗生素和對照的小鼠體內分離噬菌體與細菌群落共培養，與口服抗生素小鼠體內分離的噬菌體共培養的細菌耐藥比例相比對照增加 2～3倍;抗生素的選擇壓力促進了噬菌體和細菌間的基因交流，噬菌體可以通過基因交換改變宿主菌的抗藥表型以適應環境保證其群落的穩定，細菌群落的穩定又保證了噬菌體的正常繁殖[30]。

盡管在噬菌體DNA上檢測到耐藥基因的存在，在一些菌株之間噬菌體也可以成功介導耐藥基因的轉移，然而，目前有關噬菌體在這種傳播中的證據還非常有限。傳統的觀點認為噬菌體基因組很少編碼耐藥基因。噬菌體在耐藥基因傳播中是否發揮作用還存在爭論，還沒有一個完全公認的結論。Enault等的研究結果[31]可以說是對目前大多數研究的一個巨大反擊，他們采用生物信息學的方法評估了1 181株噬菌體基因組耐藥基因存在情況，結果表明，大多數噬菌體基因組中的耐藥基因與實際的耐藥基因的同源性很低，或者檢測到的耐藥基因實際上是沒有耐藥活性的，而目前大多數報道的噬菌體耐藥基因普遍被明顯高估。這就是說噬菌體在耐藥基因傳播中的作用很可能被普遍高估。

4 噬菌體在抗生素耐藥基因傳播中的作用

噬菌體介導基因轉移的傳統研究手段是利用選擇性培養基對轉導子進行篩選，可以直觀表征轉導結果，例如，Fard等以鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）為宿主菌分離了3株噬菌體進行轉導試驗，從基因型和表型對轉導后的受體菌進行耐藥性評估，結果顯示，在噬菌體介導作用下，四環素抗性由鶉雞腸球菌成功傳遞給了糞腸球菌;慶大霉素抗性由糞腸球菌成功傳遞給屎腸球菌（Enterococcus faecium）、海氏腸球菌（Enterococcus hirae）、耐久腸球菌（Enterococcus durans）、酪黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）等，雖然轉移頻率不高，但是也為耐藥基因的轉移提供了一個途徑，證明噬菌體在腸球菌抗生素耐藥轉移中發揮了一定作用[32]。但是這種方法依賴于轉移基因的高頻率表達，不能對細菌-噬菌體間基因流動的具體方向做定量描述，更不能在單細胞水平研究基因的交換重組情況。

Hease等將PCR的高靈敏度與熒光原位雜交技術對細胞精確定位及形態學分析技術相結合，建立了原位PCR[33]，該方法首先對細胞預處理使細胞具有適當通透性并保持完整;然后PCR各反應物進入細胞并在細胞內擴增目的基因片段，利用熒光分子標記的dNTP和引物在擴增同時或者擴增后利用DNA分子雜交和免疫細胞化學技術等，使擴增產物帶上熒光信號并在細胞內原位停留;最后用熒光顯微鏡檢測目的基因。原位PCR技術可以在組織切片、細胞等樣品中檢測低拷貝的DNA或RNA，并在形態學上精確定位，通過揭示細胞內低拷貝基因的分布，可對病毒感染、基因突變、基因重排、基因低水平表達等進行深入研究。原位PCR為噬菌體-細菌間基因流動提供一個直觀的檢測手段。Hease等利用原位PCR成功擴增檢測到真核細胞中Visna病毒的DNA[33]。Kenzaka等利用與原位PCR原理相同方法即循環引物介導的原位標記-熒光原位雜交（cycling primed in situ amplification-fluorescent in situ hybridization，簡稱CPRINS-FISH）精確研究噬菌體介導的氨芐青霉素耐藥基因在大腸桿菌細胞間的轉移頻率，以噬菌體P1、T4、EC10等作為轉移工具直接計數，結果顯示其基因轉移頻率分別為10-8～10-6、10-8、10-9～10-8;CPRINS-FISH檢測結果顯示其轉移頻率均在10-4～10-3之間;直接計數和CPRINS-FISH檢測結果均表明，超過20%的受體菌攜帶供體菌的基因并發揮一定的生理功能[34]。2010年，Kenzaka等用相同方法再次證明噬菌體在細菌基因交換中發揮著重要作用[35]。噬菌體傳遞基因給其宿主菌以利于宿主適應不同的環境，從而促進自己的生存和增殖。這種基因交換表明噬菌體在其宿主適應不同環境壓力中發揮重要作用。

由噬菌體介導的水平轉移頻率一般在10-10～10-2之間，但轉移頻率與環境生化特征、受體菌及噬菌體本身特性相關。Mcdaniel等對沿海地域和海洋的最新研究得出了較高的轉導頻率，可達10-3～10-1[36]。

噬菌體所介導的耐藥基因轉移可以發生在同種不同菌株之間，也可以發生在不同種細菌之間，報道最多的是大腸桿菌的不同菌株之間，以及鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的不同菌株之間，詳見表2。Beumer等研究發現，在寬宿主噬菌體D3112、UT1、SN-T中均檢測到16S rRNA基因的存在，這就表明噬菌體和宿主菌存在活躍的基因交流[37]。

5 噬菌體在耐藥基因轉移中的作用展望

在不同環境的噬菌體DNA上檢測到不同抗生素耐藥基因的事實讓我們不得不思考，噬菌體在耐藥基因的起源和傳播中扮演著怎樣的角色。噬菌體DNA上攜帶耐藥基因，這就為噬菌體傳播耐藥基因提供了物質基礎。攜帶有耐藥基因的噬菌體隨著人類或動物的糞便排放到環境中，生物體和環境之間定然有一個噬菌體循環，這些沒有被人發現的噬菌體附著在食物或存在于水體中。當進入腸道中遇到合適的宿主菌，噬菌體便可通過轉導實現耐藥基因的轉移，獲得耐藥基因的宿主菌在抗生素選擇壓力的作用下成為優勢種群。噬菌體在耐藥基因傳播中的作用主要建立在如下推測：首先，噬菌體DNA上檢測到不同種類的抗生素耐藥基因，可能是一個潛在的耐藥基因庫;其次，相比宿主菌來說，不管溫和噬菌體或烈性噬菌體其在水環境中存活能力更強[46];最后，由于噬菌體的結構優勢，其在環境中的活力優于游離的DNA，如線性DNA片段或質粒[47]，因此，借助噬菌體的主動侵染活性，應該比轉化所介導的基因轉移更具有優越性。另一方面，由于目前報道的寬宿主噬菌體的存在，使它們在環境中的適應性更強，相比接合作用所介導的基因轉移來說也有更多的機會在不同種屬細菌之間進行基因交換。然而Enault等的研究結果[31]也值得關注，噬菌體基因組上很少攜帶耐藥基因或者所攜帶的與目前已知的耐藥基因具有相似性的片段沒有活性，那么噬菌體到底如何介導基因轉移呢？關于噬菌體在耐藥基因所有的結論似乎都太早，須要更多的研究數據來證明。

環境噬菌體宏基因組研究結果顯示，大多數噬菌體的開放閱讀框（open reading frames，簡稱ORF）與GenBank數據庫中的已知基因序列無明顯相似性，例如，Breitbart等對海水和海底沉積物進行測序，結果顯示，樣品中出現約65%的新序列[47]。Rohwer在文章中假設，若環境中有1億種噬菌體，每個噬菌體可編碼50個ORFs，其中有50%的ORFs是新序列，那么環境中的噬菌體可能包含了25億全新的ORFs，全球只有小于0.000 2%的噬菌體宏基因組已被采樣研究[48]。由此可見，我們對噬菌體基因組的了解只是冰山一角，噬菌體基因組上存在大量未知功能基因，這些片段是否與耐藥基因或耐藥基因轉移相關還須要深入研究。

目前報道的數據顯示，噬菌體很可能在抗生素耐藥基因傳播中發揮一定作用，但是與質粒、轉座子等可移動元件相比其貢獻比例尚未明確。首先，環境中可培養的細菌不到1%，因此通過雙層培養所獲得的噬菌體數量將遠遠低于噬菌體種類的1%;其次;目前國內外還沒有噬菌體完整的基因信息數據庫，想要繞過培養障礙從基因層面研究噬菌體和細菌的關系還存在困難;最后;噬菌體并不全是寬宿主，且難分離，這就導致轉導試驗在實驗室難以大規模進行，無法積累足夠的數據證明轉導的直觀貢獻。噬菌體從發現至今已有百年歷史，但其生命規律及其在生態環境中的地位還未完全了解，噬菌體的研究道路還很長。

參考文獻：

[1]Hvistendahl M. China takes aim at rampant antibiotic resistance[J]. Science，2012，336（6083）：795.

[2]Looft T，Johnson T A，Allen H K，et al. In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（5）：1691-1696.

[3]Zhu Y G，Johnson T A，Su J Q，et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110（9）：3435-3440.

[4]Sarmah A K，Meyer M T，Boxall A B. A global perspective on the use，sales，exposure pathways，occurrence，fate and effects of veterinary antibiotics （VAs） in the environment[J]. Chemosphere，2006，65（5）：725-759.

[5]孫 剛，袁守軍，計 峰，等. 畜禽糞便中抗生素殘留危害及其研究進展[J]. 環境與健康雜志，2009，26（3）：277-279.

[6]楊鳳霞，毛大慶，羅 義，等. 環境中抗生素抗性基因的水平傳播擴散[J]. 應用生態學報，2013，24（10）：2993-3002.

[7]張 昊，王盼亮，楊清香. 畜禽糞便中多重耐藥細菌及耐藥基因研究[J/OL]. 北京：中國科技論文在線（2017-04-26）[2017-09-23]. http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201704-606.

[8]Marta C L，Juan J，Maite M，et al. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples[J]. PLoS One，2011，6（3）：e17549.

[9]Quiros P，Colomer-Lluch M，Martinez-Castillo A，et al. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of human fecal samples[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2014，58（1）：606-609.

[10]Lang A S，Zhaxybayeva O，Beatty J T. Gene transfer agents：phage-like elements of genetic exchange[J]. Nature Reviews Microbiology，2012，10（7）：472-482.

[11]Muniesa M，Imamovic L，Jofre J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments[J]. Microbial Biotechnology，2011，4（6）：725-734.

[12]Parsley L C，Consuegra E J，Kakirde K S，et al. Identification of diverse antimicrobial resistance determinants carried on bacterial，plasmid，or viral metagenomes from an activated sludge microbial assemblage[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（11）：3753-3757.

[13]Breitbart M，Thompson L R，Suttle C A，et al. Exploring the vast diversity of Marine viruses[J]. Oceanography，2007，20（2）：135-139.

[14]Fuhrman J A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects[J]. Nature，1999，399（6736）：541-548.

[15]Letarov A，Kulikov E. The bacteriophages in human-and animal body-associated microbial communities[J]. Journal of Applied Microbiology，2009，107（1）：1-13.

[16]Liu B，Zhou F F，Wu S J，et al. Genomic and proteomic characterization of a thermophilic Geobacillus bacteriophage GBSV1[J]. Research in Microbiology，2009，160（2）：166-171.

[17]Rodriguez-Valera F，Martin-Cuadrado A-，Pasic L，et al. OPINION explaining microbial population genomics through phage predation[J]. Nature Reviews Microbiology，2009，7（11）：828-836.

[18]Hao X D，Wang Q L，Cao Y L，et al. Evaluating sludge minimization caused by predation and viral infection based on the extended activated sludge model No. 2d[J]. Water Research，2011，45（16）：5130-5140.

[19]Khan M A，Satoh H，Katayama H，et al. Bacteriophages isolated from activated sludge processes and their polyvalency[J]. Water Research，2002，36（13）：3364-3370.

[20]Brussow H，Canchaya C，Hardt W D. Phages and the evolution of bacterial pathogens：from genomic rearrangements to lysogenic conversion[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2004，68（3）：560-602.

[21]Colomer-Lluch M，Calero-Cáceres W，Jebri S，et al. Antibiotic resistance genes in bacterial and bacteriophage fractions of Tunisian and Spanish wastewaters as markers to compare the antibiotic resistance patterns in each population[J]. Environment International，2014，73：167-175.

[22]Colomer-Lluch M，Jofre J，Muniesa M. Quinolone resistance genes （qnrA and qnrS） in bacteriophage particles from wastewater samples and the effect of inducing agents on packaged antibiotic resistance genes[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2014，69（5）：1265-1274.

[23]Marti E，Variatza E，Balcazar J L. Bacteriophages as a reservoir of extended-spectrum β-lactamase and fluoroquinolone resistance genes in the environment[J]. Clinical Microbiology and Infection，2014，20（7）：O456-O459.

[24]Colomer-Lluch M，Imamovic L，Jofre J，et al. Bacteriophages carrying antibiotic resistance genes in fecal waste from cattle，pigs，and poultry[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2011，55（10）：4908-4911.

[25]Calero-Cáceres W，Muniesa M. Persistence of naturally occurring antibiotic resistance genes in the bacteria and bacteriophage fractions of wastewater[J]. Water Research，2016，95：11-18.

[26]Calero-Caceres W，Melgarejo A，Colomer-Lluch M A，et al. Sludge as a potential important source of antibiotic resistance genes in both the bacterial and bacteriophage fractions[J]. Environmental Science and Technology，2014，48（13）：7602-7611.

[27]Ross J，Topp E. Abundance of antibiotic resistance genes in bacteriophage following soil fertilization with dairy manure or municipal biosolids，and evidence for potential transduction[J]. Applied and Environmental Microbiology，2015，81（22）：7905-7913.

[28]Minot S，Sinha R，Chen J，et al.The human gut virome：inter-individual variation and dynamic response to diet[J]. Genome Research，2011，21（10）：1616-1625.

[29]Liu B，Pop M. ARDB—Antibiotic resistance genes database[J]. Nucleic Acids Research，2009，37（S1）：D443-D447.

[30]Modi S R，Lee H H，Spina C S，et al. Antibiotic treatment expands the resistance reservoir and ecological network of the phage metagenome[J]. Nature，2013，499（7457）：219.

[31]Enault F，Briet A，Bouteille L，et al. Phages rarely encode antibiotic resistance genes：a cautionary tale for virome analyses[J]. ISME Journal，2017，11（1）：237-247.

[32]Fard R，Barton M D，Heuzenroeder M W. Bacteriophage-mediated transduction of antibiotic resistance in enterococci[J]. Letters in Applied Microbiology，2011，52（6）：559-564.

[33]Haase A T，Retzel E F，Staskus K A . Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1990，87（13）：4971-4975.

[34]Kenzaka T，Tani K，Sakotani A，et al. High-frequency phage-mediated gene transfer among Escherichia coli cells，determined at the single-cell level[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（10）：3291-3299.

[35]Kenzaka T，Tani K，Nasu M. High-frequency phage-mediated gene transfer in freshwater environments determined at single-cell level[J]. The ISME Journal，2010，4（5）：648-659.

[36]McDaniel L D，Young E，Delaney J，et al. High frequency of horizontal gene transfer in the oceans[J]. Science，2010，330（6000）：50.

[37]Beumer A，Robinson J B. A broad-host-range，generalized transducing phage （SN-T） acquires 16S rRNA genes from different genera of bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（12）：8301-8304.

[38]Schmieger H，Schicklmaier P. Transduction of multiple drug resistance of Salmonella enterica serovar typhimurium DT104[J]. FEMS Microbiology Letters，1999，170（1）：251-256.

[39]Taniashin V I，Zimin A A，Shliapnikov M G，et al.Transduction of plasmid antibiotic resistance determinants with pseudo-T-even bacteriophages[J]. Genetika，2003，39（7）：914-926.

[40]Kenzaka T，Tani K，Sakotani A，et al. High-frequency phage-mediated gene transfer among Escherichia coli cells，determined at the single-cell level[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（10）：3291-3299.

[41]Zhang Y F，Lejeune J T. Transduction of blaCMY-2，tet（A），and tet（B） from Salmonella enterica subspecies enterica serovar Heidelberg to S. typhimurium[J]. Veterinary Microbiology，2008，129（3/4）：418-425.

[42]Battaglioli E J，Baisa G A，Weeks A E，et al. Isolation of generalized transducing bacteriophages for uropathogenic strains of Escherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（18）：6630-6635.

[43]Marinus M G，Poteete A R. High efficiency generalized transduction in Escherichia coli O157：H7[J]. F1000 Research，2013，2（7）：1-7.

[44]Bearson B L，Allen H K，Brunelle B W，et al. The agricultural antibiotic carbadox induces phage-mediated gene transfer in Salmonella[J]. Frontiers in Microbiology，2014，5（52）：1-8.

[45]Bearson B L，Brunelle B W. Fluoroquinolone induction of phage-mediated gene transfer in multidrug-resistant Salmonella[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2015，46（2）：201-204.

[46]Duran A E，Muniesa M，Mendez X，et al. Removal and inactivation of indicator bacteriophages in fresh waters[J]. Journal of Applied Microbiology，2002，92（2）：338-347.

[47]Breitbart M，Salamon P，Andresen B，et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（22）：14250-14255.

[48]Rohwer F. Global phage diversity[J]. Cell，2003，113（2）：141.陳 園，趙淑娟. 微生物莽草酸代謝途徑的研究進展[J]. 江蘇農業科學，2019，47（7）：19-23.