基于棉花轉錄組測序的SSR分子標記的開發

劉冬梅 婁喜艷 吳狄

摘要：通過對棉花轉錄組進行測序獲得的57 695條Unigenes，利用MISA軟件進行搜索，得出簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）的分布情況，共挖掘檢索得到1 886個SSR位點，SSR的出現頻率為3.27%。所有SSR位點分布于1 759條Unigenes上，發生頻率為3.05%，平均每20.8 kb會出現1個SSR位點。有117條Unigenes含有1個以上SSR位點，含有復合型SSR的Unigenes數目為56條，其中三核苷酸基元類型分布最多，SSR數量為 1 582個，占挖掘出總SSR數量的83.88%，而單、二、四、五、六核苷酸重復類型所占的比例較小。最后通過Primer 3程序進行SSR引物設計，得到部分引物序列，可用于棉花遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種以及種質資源的保存等。

關鍵詞：棉花;轉錄組測序;SSR;分子標記;引物設計

中圖分類號： S562.024 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0032-03

微衛星DNA，即簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR），通常構成其重復基元的核苷酸個數為1～6個，特點是長度長達幾十個核苷酸，為串聯重復序列。單一序列的保守性較強，在基因組中，微衛星側翼序列就有此特性。因此首先通過克隆相應的微衛星側翼DNA片段，對其數目進行擴增，然后對擴增DNA進行全部測序，再對微衛星的側翼序列引物進行人工合成，最終實現通過PCR擴增微衛星的目的。自分子領域發展以來，人們最常用的分子標記技術主要有隨機擴增多態性DNA（RAPD）、擴增片段長度多態性（AFLP）、序列標簽位點（STS）、限制性片段長度多態性（RFLP）、單核苷酸多態性（SNP）、SSR等[1-6]。與其他分子標記相比，SSR標記具有其獨特的優點，（1）SSR標記的操作非常簡便，無需消耗大量試驗器材即可進行，整個過程消耗的時間較其他幾種分子標記短，且對于多態性而言，SSR標記所發掘出的多態性較高;（2）SSR標記所開發的位點具有多等位基因的特性，且在分子水平上，其提供的信息量較高;（3）SSR標記識別出的基因位點呈共顯性，在整個基因組有著均勻分布，且整個過程無放射、輻射危險。SSR標記適用于DNA指紋圖譜的構建[7]、基因定位[8]和遺傳多樣性分析[9]等方面。高度變異是微衛星中重復基元的顯著特性，微衛星數目可呈現出整倍性變異，并且重復基元序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多個位點的多態性。

目前關于棉花全基因組SSR分子標記開發的研究報道較少，隨著棉花品種數量的逐漸增多，田間表型農藝性狀鑒定方法已難以滿足快速并準確鑒定品種、質量、親緣關系等的需求。本研究以陸地棉洞A轉錄組的測序結果為試驗材料，對全轉錄組SSR位點進行挖掘，利用生物信息學技能和MISA軟件，發掘基于陸地棉洞A基因型的SSR分子標記數據，在RNA水平上分析棉花SSR的特點及規律，以期為在分子水平上研究棉花種質資源、鑒定親緣關系及進行分子輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 棉花轉錄組數據來源

2014年8月，以陸地棉洞A不育和可育花藥為材料，委托深圳華大基因科技有限公司進行轉錄組測序，獲得的全基因序列共包含57 695條Unigenes，以此為材料進行SSR位點的挖掘。

1.2 棉花轉錄組SSR位點檢索

利用SSR位點挖掘軟件MISA對陸地棉洞A花藥的 57 695 條Unigenes進行SSR位點挖掘，共挖掘出6種不同類別的SSR，分別是單、二、三、四、五、六核苷酸SSR。

1.3 SSR引物挖掘

利用MISA軟件進行SSR位點挖掘之前首先將單、二、三、四、五、六核苷酸重復次數的操作參數分別設置為 ≥12 bp、≥6 bp、≥5 bp、≥5 bp、≥4 bp、≥4 bp;其次對長度條件參數進行設置，當2個微衛星可以組合為1個復合微衛星時，這2個微衛星之間的距離必須小于100 bp。

1.4 引物設計

通過Primer 3程序進行SSR引物設計。

2 結果與分析

2.1 棉花轉錄組序列中SSR位點的數量

通過MISA軟件對棉花轉錄組獲得的Unigenes進行挖掘，從表1可以看出，共挖掘出1 886個SSR位點，SSR出現頻率（搜索出的SSR數量與搜索序列總數的比值）為3.27%。所有SSR位點分布于1 759條Unigenes上，發生頻率（搜索出的含有SSR序列的數量與搜索序列總數的比值）為3.05%，平均每20.8 kb會出現1個SSR位點（搜索出的序列總長度與SSR總數量的比值）。其中含有1個以上SSR位點的Unigenes數量較少，有117條;含復合型SSR的序列數更少，為56條。

2.2 棉花轉錄組SSR基元頻率特征及引物設計

由表2可知，棉花轉錄組的SSR種類較為豐富，本研究共挖掘到86種重復的SSR類型，且各重復類型之間的數量差別較大，分布極其不平衡。棉花轉錄組中三核苷酸SSR重復基元類型的分布最多，SSR重復基元數量為1 582個，占挖掘出總SSR數量的83.88%;SSR位點數范圍為1～393個，最多的為AAG/CTT，其次是ATC/ATG，數量為 325個，AGC/CTG的數量為216個，ACC/GGT數量為209個。單、二、四、五、六核苷酸重復類型所占的比例較小，SSR重復基元數量分別為66、92、15、11、120個，總比例之和為16.12%。在棉花轉錄組Unigenes中，重復基元類型最多的是六核苷酸，為61種;其次是三核苷酸重復類型，有10種。從圖1可以看出，在三核苷酸重復基元類型中，AAG/CTT的SSR位點數量最多，為393個，占總SSR位點數量的20.84%，發生頻率為0.68%;其次是ATC/ATG，占總SSR位點數量的 17.23%;再次是AGC/CTG，占11.45%;ACC/GGT較少，占1108%;其他三核苷酸重復基元類型占總SSR位點的2328%。單、二、四、五、六核苷酸重復類型數量分別為2、4、3、6種，共占重復類型總數的17.44%。通過對棉花轉錄組57 695條序列進行SSR位點搜索，共搜索得到 1 886 個SSR位點，利用Primer 3引物設計程序所得出的部分SSR位點特異引物見表3。

2.3 棉花轉錄組序列中SSR基元重復次數分布

SSR位點的多態性是由基元重復次數的變化所決定的，通過棉花SSR位點重復次數分布統計結果（圖2）可以得出，棉花轉錄組基元隨著重復次數的增加，其數量和比例逐漸減少。棉花轉錄組SSR中基元重復次數主要集中在4～7次，占總數的94.91%，其中重復8～10次的SSR位點數量為28個，占總數的1.48%;重復11～14次數的SSR位點為61個（3.23%），重復15～17次的SSR位點有7個（0.37%），其中重復16次的SSR位點有0個。重復次數多于20次為較高重復次數，棉花轉錄組中沒有重復次數高于17次的SSR位點，即無高重復次數的SSR位點，低重復次數（重復1～10次）與一般重復次數（重復11～20次）的SSR位點較多。

3 討論

本研究利用棉花花藥的轉錄組序列數據，從57 695條序列中成功挖掘檢索出1 886個SSR位點， 棉花轉錄組序列中SSR位點的總發生頻率為3.05%，通過對比杜仲（2.90%）[10]、南方紅豆杉（2.07%）[11]可以發現，棉花轉錄組序列中SSR位點的發生頻率略高，但略低于紅松（4.24%）[12]，且明顯低于櫻桃（15.62%）[13]。棉花轉錄組SSR標記重復次數最多的是三核苷酸重復基元類型，高級基元重復次數較為微小，且跨度大，可為基元的重復次數與SSR標記的多態性呈正相關提供依據[14]。三核苷酸中的AAG/CTT基元的豐度最高，這與海甘藍三核苷酸為豐度最高的基元[15]一致，即棉花轉錄組SSR中三核苷酸SSR在理論上具備更高的多態性，可作為潛在的SSR重復基序進行有關的引物挖掘及開發。由此推測，通過利用棉花轉錄組得到的SSR引物，同樣可以用來進行棉花的遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種以及種質資源的保存等。

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