響應(yīng)面優(yōu)化萃取寧夏枸杞類胡蘿卜素工藝研究

鄭堅(jiān)強(qiáng) 葉豪 司俊玲

摘要：以寧夏枸杞為原材料，采用有機(jī)溶劑為萃取劑，在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化類胡蘿卜素萃取工藝中的料液比、萃取時(shí)間、萃取溫度以及有機(jī)溶劑混合的比例。采用DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）自由基清除劑測(cè)量寧夏枸杞中類胡蘿卜素的抗氧化活性。結(jié)果表明，無(wú)水乙醇和石油醚體積比為2 ∶ 1，料液比為1 g ∶ 10 mL，溫度為40 ℃，萃取時(shí)間為50 min時(shí)，萃取效果最好。萃取的類胡蘿卜素自由基清除率為90.57%，說(shuō)明寧夏枸杞中的類胡蘿卜素有較高的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：枸杞;類胡蘿卜素;響應(yīng)面優(yōu)化;抗氧化活性

中圖分類號(hào)： R284.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0197-05

類胡蘿卜素（carotenoids）是一種多烯類物質(zhì)，一般由8個(gè)類異戊二烯單位組成，有抗氧化作用[1-2]，同時(shí)還有抗癌、預(yù)防夜盲癥等功效[3-4];其著色能力強(qiáng)，是安全、可靠、顏色自然的天然色素，越來(lái)越受到人們的喜愛。迄今為止人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了600多種類胡蘿卜素，促進(jìn)了食品工業(yè)的發(fā)展[5]。類胡蘿卜素對(duì)光、熱、氧等條件比較敏感，穩(wěn)定性較差，因此對(duì)于類胡蘿卜素的萃取技術(shù)研究，一直在不斷發(fā)展和改進(jìn)[6-8]。

類胡蘿卜素是脂溶性物質(zhì)，可選擇不同的有機(jī)溶劑萃取（例如用石油醚萃取β-胡蘿卜素） [9]，或者用多種有機(jī)溶劑同時(shí)萃取，Melendez-Martinez等用比例為1 ∶ 1 ∶ 2的甲醇 ∶ 丙酮 ∶ 正丁烷混合液萃取橘汁中的類胡蘿卜素[10]。但要分析有機(jī)物都相溶性，如甲醇和石油醚密度相差過(guò)大，會(huì)分層而不相溶[11]。有機(jī)溶劑萃取方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)節(jié)約，在工業(yè)生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用。

本試驗(yàn)通過(guò)控制有機(jī)溶劑含量、萃取時(shí)間、溫度以及料液比等變量，比較不同條件下萃取效果，并用DPPH自由基清除劑測(cè)量類胡蘿卜素的抗氧化活性，以期為從我國(guó)優(yōu)勢(shì)植物資源中萃取類胡蘿卜素積累研究經(jīng)驗(yàn)，為進(jìn)一步開發(fā)枸杞深加工產(chǎn)品提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料 枸杞（產(chǎn)地：寧夏榮平），食品級(jí)，低溫貯藏。

1.1.2 試劑 無(wú)水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）;1-1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）[分析純，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]。

1.1.3 儀器與設(shè)備 高速多功能粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（成都勝拓儀器有限公司）;真空泵（杭州海馳科技有限公司）;紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）;真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枸杞冷凍干燥 枸杞的顆粒較大，采用真空冷凍方法去除水分（真空度為-0.2 MPa，冷凍干燥時(shí)間為12 h，溫度為 -40 ℃），然后粉碎成粉末。將制得的枸杞粉末在密閉、低溫、避光條件下貯藏。

1.2.2 類胡蘿卜素的萃取方法 經(jīng)查閱資料和預(yù)試驗(yàn)，甲 醇- 無(wú)水乙醇正交試驗(yàn)、乙醇-石油醚正交試驗(yàn)和乙醇-乙酸乙酯正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)見表1至表3。

1.2.2.1 甲醇-無(wú)水乙醇正交試驗(yàn) 甲醇-無(wú)水乙醇正交試驗(yàn)，選取L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表1）。

精確稱取寧夏榮平枸杞粉末1.00 g（將實(shí)際值記錄好），放入試管中，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同體積比甲醇-無(wú)水乙醇混合溶液，充分振蕩，溫度、時(shí)間按照正交設(shè)計(jì)實(shí)施。萃取結(jié)束后，將試管從水浴鍋中取出，再次振蕩;將靜置后的溶液用真空泵抽濾，棄去枸杞粉末，將澄清液定容到50 mL容量瓶中待測(cè)。定容后的溶液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定類胡蘿卜素的吸光度。類胡蘿卜素在450 nm處有最大吸光度，因此在該波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式（1）計(jì)算類胡蘿卜素含量[12]。

1.2.2.2 乙醇-石油醚正交試驗(yàn) 按照乙醇-石油醚的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)施。用公式（1）計(jì)算萃取的類胡蘿卜素含量。

1.2.2.3 乙醇-乙酸乙酯的正交試驗(yàn) 按照無(wú)水乙醇-乙酸乙酯的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)施。用公式（1）計(jì)算萃取的類胡蘿卜素含量。

1.2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化法試驗(yàn) 采用無(wú)水乙醇-石油醚試劑作響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)按照乙醇-石油醚響應(yīng)面設(shè)計(jì)（表4）中的相應(yīng)溫度、萃取時(shí)間、料液比和無(wú)水乙醇-石油醚配比實(shí)施。用公式（1）計(jì)算萃取的類胡蘿卜素含量。

1.3 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.1 DPPH溶液的配置 精密稱取DPPH粉末3.94 mg，加入具塞棕色錐形瓶中，加入100.00 mL無(wú)水乙醇，搖勻，獲得濃度為0.10 mmol/L的DPPH乙醇溶液。試驗(yàn)避光進(jìn)行。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 準(zhǔn)備4個(gè)試管，分別標(biāo)注D樣品、D對(duì)照、D空白、空白，其中空白用于調(diào)零。吸取DPPH溶液2.00 mL分別加入D樣品和D對(duì)照試管中，再吸取2.00 mL無(wú)水乙醇溶液分別加入D空白和空白試管中，吸取萃樣品溶液 2.00 mL 分別加入D樣品和D空白試管中，振蕩后置于暗處反應(yīng)30 min后，在517 nm處分別測(cè)定D樣品、D空白、D對(duì)照的吸光度。然后根據(jù)公式（2）計(jì)算出萃取的類胡蘿卜素的自由基清除率[12]，表示類胡蘿卜素的抗氧化活性效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 甲醇-無(wú)水乙醇正交試驗(yàn)結(jié)果 從表5可以看出，按照極差大小，各因素對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響作用由大到小為D>A>B>C，即甲醇：無(wú)水乙醇（體積比）>溫度>萃取時(shí)間>料液比。最佳萃取條件為A3B1C1D3，即萃取溫度為60 ℃、萃取時(shí)間為60 min、料液比為1 g ∶ 10 mL，甲醇 ∶ 無(wú)水乙醇=1 ∶ 3（體積比）。利用正交試驗(yàn)優(yōu)化的條件萃取枸杞中類胡蘿卜素，測(cè)得的類胡蘿卜素含量為69.58 mg/100 g。

2.1.2 無(wú)水乙醇-石油醚正交試驗(yàn)結(jié)果 從表7可以看出，按照極差大小，各因素對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響作用由大到小為C>A>B>D，即料液比>溫度>萃取時(shí)間>無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）。最佳萃取條件為A1B2C1D2，即萃取溫度為40 ℃，萃取時(shí)間為50 min，料液比為1 g ∶ 10 mL，無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚=1 ∶ 2（體積比）。用試驗(yàn)得出的優(yōu)化條件，測(cè)得的類胡蘿卜素含量為 317.56 mg/100 g。從無(wú)水乙醇-石油醚正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果（表8）可以看出， 各因素影響不顯著。

2.1.3 無(wú)水乙醇-乙酸乙酯正交試驗(yàn) 無(wú)水乙醇與乙酸乙酯的正交試驗(yàn)結(jié)果見表9。從表中可以看出，各因素對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響作用從大到小排列為C>D>A>B，即料液比>乙醇 ∶ 乙酸乙酯（體積比）>溫度>萃取時(shí)間。萃取效果最好的條件為A1B3C1D2，即萃取溫度為40 ℃、萃取時(shí)間為60 min、料液比1 g ∶ 10 mL、無(wú)水乙醇 ∶ 乙酸乙酯=1 ∶ 2 （體積比）。利用優(yōu)化條件，測(cè)得的類胡蘿卜素含量為286.75 mg/100 g。

2.2 無(wú)水乙醇-石油醚有機(jī)萃取響應(yīng)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Design-Expert 8.02軟件中的中心組合試驗(yàn)（Box-Behnken）原理，選取溫度（℃）、萃取時(shí)間（min）、料液比（g ∶ mL）、乙醇 ∶ 石油醚（體積比）為試驗(yàn)因素，以寧夏枸杞中類胡蘿卜素萃取液所測(cè)得的類胡蘿卜素含量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

得到萃取的類胡蘿卜素含量對(duì)萃取溫度（℃）、萃取時(shí)間（min）、料液比（g ∶ mL）、無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）的回歸方程。

類胡蘿卜素含量=318.75-6.82X1+6.37X2+5.47X3-1.18X4-8.25X1X2-17.29X1X3+10.73X1X4+12.77X2X3+17.29X2X4+13.47X3X4-21.83X12-27.26X22-16.53X32-15.18X42。

表11為無(wú)水乙醇-石油醚萃取響應(yīng)面分析的設(shè)計(jì)方案及結(jié)果。

由表12可知，模擬交互項(xiàng)中X1X3、X2X4影響顯著（P<0.05），在模擬的平方項(xiàng)中X12、X22、X32、X42影響顯著（P<0.05）。各因素對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響從大到小順序?yàn)闇囟?萃取時(shí)間>料液比>乙醇 ∶ 石油醚（體積比）。模型中的調(diào)整確定系數(shù)RAdj=95.93%，說(shuō)明該模型能解釋95.93%響應(yīng)值的變化。得出的優(yōu)化條件為萃取溫度45 ℃，萃取時(shí)間50 min，料液比1 g ∶ 12.5 mL，無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚=1 ∶ 1（體積比），在此條件下測(cè)得的類胡蘿卜素含量為327.57 mg/100 g。

從圖1可以看出，在固定料液比和無(wú)水乙醇與石油醚比例時(shí)，萃取時(shí)間與溫度的交互作用對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當(dāng)固定萃取時(shí)間不變時(shí)，隨著溫度的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降，當(dāng)溫度為47 ℃時(shí)萃取的類胡蘿卜素含量最高。當(dāng)溫度固定不變時(shí)，隨著萃取時(shí)間的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先增加，在趨于60 min時(shí)略有下降，在55 min時(shí)萃取的類胡蘿卜素含量最高。

從圖2可以看出， 在固定萃取時(shí)間和無(wú)水乙醇與石油醚比例時(shí)，料液比與溫度的交互作用對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當(dāng)料液比固定不變時(shí)，隨著溫度的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降，當(dāng)溫度在45 ℃左右時(shí)萃取的類胡蘿卜素含量最高。當(dāng)溫度固定不變時(shí)，隨著料液比的增加，萃取的類胡蘿卜素含量呈上升趨勢(shì)。

從圖3可以看出，在固定萃取時(shí)間和料液比時(shí)，無(wú)水乙醇與石油醚的比例和溫度的交互作用對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當(dāng)無(wú)水乙醇與石油醚比例固定不變時(shí)，隨著溫度的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降，當(dāng)溫度在45 ℃左右時(shí)萃取的類胡蘿卜素含量最高。當(dāng)溫度固定不變時(shí)，隨著無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚的比例增大，萃取的類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

從圖4可以看出，在固定溫度和無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）時(shí)，萃取時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)萃取類胡蘿卜素含量的影響。當(dāng)料液比固定不變時(shí)，隨著萃取時(shí)間的增加，枸杞中類胡蘿卜素含量先上升后下降。當(dāng)萃取時(shí)間固定不變時(shí)，隨著料液比的增加，萃取的類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。

從圖5可以看出，在溫度和料液比固定時(shí)，無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）和萃取時(shí)間的交互作用對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當(dāng)無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）固定不變時(shí)，隨著萃取時(shí)間的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降。當(dāng)萃取時(shí)間固定不變時(shí)，隨著無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚的比例增大，萃取的類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。

從圖6可以看出，在溫度和萃取時(shí)間固定時(shí)，無(wú)水乙醇與石油醚的比例和料液比的交互作用對(duì)萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當(dāng)無(wú)水乙醇與石油醚比例固定不變時(shí)，隨著料液比的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降。當(dāng)料液比固定不變時(shí)，隨著無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚的比例增大，萃取的類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

2.3 自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)萃取的類胡蘿卜素，自由基平均清除率為90.57%，具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)有機(jī)萃取法萃取寧夏枸杞中的類胡蘿卜素。在單因素的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)、響應(yīng)優(yōu)化試驗(yàn)可以找出最優(yōu)萃取類胡蘿卜素的條件。

通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化萃取工藝，結(jié)果表明，選用無(wú)水乙醇和石油醚作混合有機(jī)溶劑萃取效果較好。正交試驗(yàn)最佳條件為：溫度40 ℃，萃取時(shí)間50 min，料液比1 g ∶ 10 mL，無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚=1 ∶ 2（體積比），萃取得到的類胡蘿卜素含量為317.56 mg/100 g。

在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳萃取工藝，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，萃取類胡蘿卜素最佳條件為：溫度 45 ℃，萃取時(shí)間50 min，料液比1 g ∶ 12.5 mL，無(wú)水乙醇 ∶ 石油醚=1 ∶ 1（體積比），該條件下，枸杞中類胡蘿卜素含量為 327.57 mg/100 g，比正交試驗(yàn)的萃取得率高3.2%。通過(guò)抗氧化活性的測(cè)定，枸杞中類胡蘿卜素自由基清除率為 90.57%，抗氧化活性較高。

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