響應面優化萃取寧夏枸杞類胡蘿卜素工藝研究

鄭堅強 葉豪 司俊玲

摘要：以寧夏枸杞為原材料，采用有機溶劑為萃取劑，在正交試驗的基礎上，通過響應面試驗優化類胡蘿卜素萃取工藝中的料液比、萃取時間、萃取溫度以及有機溶劑混合的比例。采用DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）自由基清除劑測量寧夏枸杞中類胡蘿卜素的抗氧化活性。結果表明，無水乙醇和石油醚體積比為2 ∶ 1，料液比為1 g ∶ 10 mL，溫度為40 ℃，萃取時間為50 min時，萃取效果最好。萃取的類胡蘿卜素自由基清除率為90.57%，說明寧夏枸杞中的類胡蘿卜素有較高的抗氧化活性。

關鍵詞：枸杞;類胡蘿卜素;響應面優化;抗氧化活性

中圖分類號： R284.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0197-05

類胡蘿卜素（carotenoids）是一種多烯類物質，一般由8個類異戊二烯單位組成，有抗氧化作用[1-2]，同時還有抗癌、預防夜盲癥等功效[3-4];其著色能力強，是安全、可靠、顏色自然的天然色素，越來越受到人們的喜愛。迄今為止人們已經發現了600多種類胡蘿卜素，促進了食品工業的發展[5]。類胡蘿卜素對光、熱、氧等條件比較敏感，穩定性較差，因此對于類胡蘿卜素的萃取技術研究，一直在不斷發展和改進[6-8]。

類胡蘿卜素是脂溶性物質，可選擇不同的有機溶劑萃取（例如用石油醚萃取β-胡蘿卜素） [9]，或者用多種有機溶劑同時萃取，Melendez-Martinez等用比例為1 ∶ 1 ∶ 2的甲醇 ∶ 丙酮 ∶ 正丁烷混合液萃取橘汁中的類胡蘿卜素[10]。但要分析有機物都相溶性，如甲醇和石油醚密度相差過大，會分層而不相溶[11]。有機溶劑萃取方法簡便、經濟節約，在工業生產上被廣泛應用。

本試驗通過控制有機溶劑含量、萃取時間、溫度以及料液比等變量，比較不同條件下萃取效果，并用DPPH自由基清除劑測量類胡蘿卜素的抗氧化活性，以期為從我國優勢植物資源中萃取類胡蘿卜素積累研究經驗，為進一步開發枸杞深加工產品提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料 枸杞（產地：寧夏榮平），食品級，低溫貯藏。

1.1.2 試劑 無水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）;1-1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）[分析純，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]。

1.1.3 儀器與設備 高速多功能粉碎機（上海冰都電器有限公司）;旋轉蒸發儀（成都勝拓儀器有限公司）;真空泵（杭州海馳科技有限公司）;紫外分光光度計（上海美普達儀器有限公司）;真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）;低溫冷卻循環泵（鄭州凱鵬實驗儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 枸杞冷凍干燥 枸杞的顆粒較大，采用真空冷凍方法去除水分（真空度為-0.2 MPa，冷凍干燥時間為12 h，溫度為 -40 ℃），然后粉碎成粉末。將制得的枸杞粉末在密閉、低溫、避光條件下貯藏。

1.2.2 類胡蘿卜素的萃取方法 經查閱資料和預試驗，甲 醇- 無水乙醇正交試驗、乙醇-石油醚正交試驗和乙醇-乙酸乙酯正交試驗因素設計見表1至表3。

1.2.2.1 甲醇-無水乙醇正交試驗 甲醇-無水乙醇正交試驗，選取L9（34）設計正交試驗（表1）。

精確稱取寧夏榮平枸杞粉末1.00 g（將實際值記錄好），放入試管中，根據正交試驗設計加入不同體積比甲醇-無水乙醇混合溶液，充分振蕩，溫度、時間按照正交設計實施。萃取結束后，將試管從水浴鍋中取出，再次振蕩;將靜置后的溶液用真空泵抽濾，棄去枸杞粉末，將澄清液定容到50 mL容量瓶中待測。定容后的溶液用紫外分光光度計測定類胡蘿卜素的吸光度。類胡蘿卜素在450 nm處有最大吸光度，因此在該波長處測定吸光度，根據公式（1）計算類胡蘿卜素含量[12]。

1.2.2.2 乙醇-石油醚正交試驗 按照乙醇-石油醚的正交試驗設計實施。用公式（1）計算萃取的類胡蘿卜素含量。

1.2.2.3 乙醇-乙酸乙酯的正交試驗 按照無水乙醇-乙酸乙酯的正交試驗設計實施。用公式（1）計算萃取的類胡蘿卜素含量。

1.2.2.4 響應面優化法試驗 采用無水乙醇-石油醚試劑作響應面優化試驗。試驗按照乙醇-石油醚響應面設計（表4）中的相應溫度、萃取時間、料液比和無水乙醇-石油醚配比實施。用公式（1）計算萃取的類胡蘿卜素含量。

1.3 抗氧化活性的測定

1.3.1 DPPH溶液的配置 精密稱取DPPH粉末3.94 mg，加入具塞棕色錐形瓶中，加入100.00 mL無水乙醇，搖勻，獲得濃度為0.10 mmol/L的DPPH乙醇溶液。試驗避光進行。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定 準備4個試管，分別標注D樣品、D對照、D空白、空白，其中空白用于調零。吸取DPPH溶液2.00 mL分別加入D樣品和D對照試管中，再吸取2.00 mL無水乙醇溶液分別加入D空白和空白試管中，吸取萃樣品溶液 2.00 mL 分別加入D樣品和D空白試管中，振蕩后置于暗處反應30 min后，在517 nm處分別測定D樣品、D空白、D對照的吸光度。然后根據公式（2）計算出萃取的類胡蘿卜素的自由基清除率[12]，表示類胡蘿卜素的抗氧化活性效果。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

2.2.1 甲醇-無水乙醇正交試驗結果 從表5可以看出，按照極差大小，各因素對萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響作用由大到小為D>A>B>C，即甲醇：無水乙醇（體積比）>溫度>萃取時間>料液比。最佳萃取條件為A3B1C1D3，即萃取溫度為60 ℃、萃取時間為60 min、料液比為1 g ∶ 10 mL，甲醇 ∶ 無水乙醇=1 ∶ 3（體積比）。利用正交試驗優化的條件萃取枸杞中類胡蘿卜素，測得的類胡蘿卜素含量為69.58 mg/100 g。

2.1.2 無水乙醇-石油醚正交試驗結果 從表7可以看出，按照極差大小，各因素對萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響作用由大到小為C>A>B>D，即料液比>溫度>萃取時間>無水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）。最佳萃取條件為A1B2C1D2，即萃取溫度為40 ℃，萃取時間為50 min，料液比為1 g ∶ 10 mL，無水乙醇 ∶ 石油醚=1 ∶ 2（體積比）。用試驗得出的優化條件，測得的類胡蘿卜素含量為 317.56 mg/100 g。從無水乙醇-石油醚正交試驗方差分析結果（表8）可以看出， 各因素影響不顯著。

2.1.3 無水乙醇-乙酸乙酯正交試驗 無水乙醇與乙酸乙酯的正交試驗結果見表9。從表中可以看出，各因素對萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響作用從大到小排列為C>D>A>B，即料液比>乙醇 ∶ 乙酸乙酯（體積比）>溫度>萃取時間。萃取效果最好的條件為A1B3C1D2，即萃取溫度為40 ℃、萃取時間為60 min、料液比1 g ∶ 10 mL、無水乙醇 ∶ 乙酸乙酯=1 ∶ 2 （體積比）。利用優化條件，測得的類胡蘿卜素含量為286.75 mg/100 g。

2.2 無水乙醇-石油醚有機萃取響應優化試驗結果

根據Design-Expert 8.02軟件中的中心組合試驗（Box-Behnken）原理，選取溫度（℃）、萃取時間（min）、料液比（g ∶ mL）、乙醇 ∶ 石油醚（體積比）為試驗因素，以寧夏枸杞中類胡蘿卜素萃取液所測得的類胡蘿卜素含量為響應值，進行響應面試驗設計。

得到萃取的類胡蘿卜素含量對萃取溫度（℃）、萃取時間（min）、料液比（g ∶ mL）、無水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）的回歸方程。

類胡蘿卜素含量=318.75-6.82X1+6.37X2+5.47X3-1.18X4-8.25X1X2-17.29X1X3+10.73X1X4+12.77X2X3+17.29X2X4+13.47X3X4-21.83X12-27.26X22-16.53X32-15.18X42。

表11為無水乙醇-石油醚萃取響應面分析的設計方案及結果。

由表12可知，模擬交互項中X1X3、X2X4影響顯著（P<0.05），在模擬的平方項中X12、X22、X32、X42影響顯著（P<0.05）。各因素對萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響從大到小順序為溫度>萃取時間>料液比>乙醇 ∶ 石油醚（體積比）。模型中的調整確定系數RAdj=95.93%，說明該模型能解釋95.93%響應值的變化。得出的優化條件為萃取溫度45 ℃，萃取時間50 min，料液比1 g ∶ 12.5 mL，無水乙醇 ∶ 石油醚=1 ∶ 1（體積比），在此條件下測得的類胡蘿卜素含量為327.57 mg/100 g。

從圖1可以看出，在固定料液比和無水乙醇與石油醚比例時，萃取時間與溫度的交互作用對萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當固定萃取時間不變時，隨著溫度的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降，當溫度為47 ℃時萃取的類胡蘿卜素含量最高。當溫度固定不變時，隨著萃取時間的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先增加，在趨于60 min時略有下降，在55 min時萃取的類胡蘿卜素含量最高。

從圖2可以看出， 在固定萃取時間和無水乙醇與石油醚比例時，料液比與溫度的交互作用對萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當料液比固定不變時，隨著溫度的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降，當溫度在45 ℃左右時萃取的類胡蘿卜素含量最高。當溫度固定不變時，隨著料液比的增加，萃取的類胡蘿卜素含量呈上升趨勢。

從圖3可以看出，在固定萃取時間和料液比時，無水乙醇與石油醚的比例和溫度的交互作用對萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當無水乙醇與石油醚比例固定不變時，隨著溫度的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降，當溫度在45 ℃左右時萃取的類胡蘿卜素含量最高。當溫度固定不變時，隨著無水乙醇 ∶ 石油醚的比例增大，萃取的類胡蘿卜素含量呈現先上升后下降的趨勢。

從圖4可以看出，在固定溫度和無水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）時，萃取時間和料液比的交互作用對萃取類胡蘿卜素含量的影響。當料液比固定不變時，隨著萃取時間的增加，枸杞中類胡蘿卜素含量先上升后下降。當萃取時間固定不變時，隨著料液比的增加，萃取的類胡蘿卜素含量呈現先上升后下降趨勢。

從圖5可以看出，在溫度和料液比固定時，無水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）和萃取時間的交互作用對萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當無水乙醇 ∶ 石油醚（體積比）固定不變時，隨著萃取時間的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降。當萃取時間固定不變時，隨著無水乙醇 ∶ 石油醚的比例增大，萃取的類胡蘿卜素含量呈現先上升后下降趨勢。

從圖6可以看出，在溫度和萃取時間固定時，無水乙醇與石油醚的比例和料液比的交互作用對萃取枸杞中類胡蘿卜素效果的影響。當無水乙醇與石油醚比例固定不變時，隨著料液比的增加，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降。當料液比固定不變時，隨著無水乙醇 ∶ 石油醚的比例增大，萃取的類胡蘿卜素含量呈現先上升后下降的趨勢。

2.3 自由基清除率的測定結果

采用響應面設計萃取的類胡蘿卜素，自由基平均清除率為90.57%，具有較好的抗氧化活性。

3 結論

本試驗通過有機萃取法萃取寧夏枸杞中的類胡蘿卜素。在單因素的基礎上通過正交試驗、響應優化試驗可以找出最優萃取類胡蘿卜素的條件。

通過正交試驗優化萃取工藝，結果表明，選用無水乙醇和石油醚作混合有機溶劑萃取效果較好。正交試驗最佳條件為：溫度40 ℃，萃取時間50 min，料液比1 g ∶ 10 mL，無水乙醇 ∶ 石油醚=1 ∶ 2（體積比），萃取得到的類胡蘿卜素含量為317.56 mg/100 g。

在正交試驗的基礎上，進一步采用響應面設計優化最佳萃取工藝，對比發現，萃取類胡蘿卜素最佳條件為：溫度 45 ℃，萃取時間50 min，料液比1 g ∶ 12.5 mL，無水乙醇 ∶ 石油醚=1 ∶ 1（體積比），該條件下，枸杞中類胡蘿卜素含量為 327.57 mg/100 g，比正交試驗的萃取得率高3.2%。通過抗氧化活性的測定，枸杞中類胡蘿卜素自由基清除率為 90.57%，抗氧化活性較高。

參考文獻：

[1]Wu D T，Cheong K L，Deng Y，et al. Characterization and comparison of polysaccharides from Lycium barbarum in China using saccharide mapping based on PACE and HPTLC[J]. Carbohydrate Polymers，2015，134：12-19.

[2]周艷華，李 濤，覃世民，等. 枸杞活性成分提取分離方法研究進展[J]. 食品研究與開發，2014，35（24）：163-166.

[3]Fang F，Peng T，Yang S M，et al. Lycium barbarum polysaccharide attenuates the cytotoxicity of mutant huntingtin and increases the activity of AKT[J]. International Journal of Developmental Neuroscience，2016，52：66-74.

[4]Zhao R，Jin R，Chen Y，et al. Hypoglycemic and hypolipidemic effects of Lycium barbarum polysaccharide in diabetic rats[J]. Chinese Herbal Medicines，2015，7（4）：310-315.

[5]徐佳佳，崔亞娟，姜菲菲，等. 幾種常見的類胡蘿卜素提取技術[J]. 食品研究與開發，2014，35（19）：141-144.

[6]田 明，徐曉云，范 鑫，等. 柑橘中主要類胡蘿卜素及其生物活性研究進展[J]. 華中農業大學學報，2015，34（5）：138-144.

[7]Bae U J，Oh M R，Park J，et al. Supplementation with Lycium chinense fruit extract attenuates methionine choline-deficient diet-induced steatohepatitis in mice[J]. Journal of Functional Foods，2017，31：1-8.

[8]Peng Q，Xu Q S，Yin H，et al. Characterization of an immunologically active pectin from the fruits of Lycium ruthenicum[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2014，64：69-75.

[9]劉長付，陳媛梅. 超聲波法提取西紅柿中類胡蘿卜素的工藝優化[J]. 食品工業，2013，34（8）：76-80.

[10]Melendez-Martinez A J，Britton G，Vicario I M，et al. The complex carotenoid pattern of orange juices from concentrate[J]. Food Chemistry，2008，109（3）：546-553.

[11]Dey S，Rathod V K. Ultrasound assisted extraction of β-carotene from Spirulina platensis[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2013，20（1）：271-276.

[12]任丹丹，彭光華，王海濱，等. 菹草類胡蘿卜素體外抗氧化活性的研究[J]. 食品科學，2005，26（3）：228-231.糾 敏，閆 鵬，閆國慶，等. 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用機制[J]. 江蘇農業科學，2019，47（7）：202-206.