蛹蟲草液體發酵菌絲體和固體栽培子實體中活性成分的比較

朱麗娜，高新華，劉艷芳，張紅霞，周 帥，張 忠，李傳華，唐慶九*

（1上海市農業科學院食用菌研究所，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，國家食用菌加工技術研發分中心，上海市農業遺傳育種重點開放實驗，上海201403；2上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海201403）

蛹蟲草［Cordycepsmilitaris（L.）Link］，又稱北蟲草、蛹草、北冬蟲夏草、蛹草菌等［1］，其含有的多糖、核苷、甾醇等多種活性成分具免疫調節、抗癌、抗氧化、抗衰老、抗病毒等作用［2-3］。蛹蟲草已實現人工規模化種植，并于2009年被批準為新資源食品，因而蛹蟲草子實體成為保健品、食品的重要原料［4］。

固體培養蛹蟲草子實體是目前蛹蟲草人工培植的主要方式，將蛹蟲草菌種接種在大米、小麥等固體培養基上，在一定的溫度、濕度和光照條件下，培養45—60 d獲得蛹蟲草子實體［5］。研究表明，深層發酵菌絲體中存在和子實體的藥用作用相同的化學物質［6-8］，具有相似的藥理作用［9-12］。以往對蛹蟲草菌液體發酵的研究主要集中在培養基和發酵條件的優化方面［13-17］，關于相同蛹蟲草菌株用不同培養方式得到的子實體和菌絲體的活性成分差異還未見報道。本研究擬比較同一蛹蟲草菌株獲得的子實體和菌絲體在多糖、核苷、游離糖醇和小分子糖類及氨基酸成分方面的差異，以期為今后不同蛹蟲草產品的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

蛹蟲草菌株（編號CM-H0810）由上海市農業科學院生態環境保護研究所蟲草課題組保藏。

1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、海藻糖、赤蘚糖醇、甘露醇為美國Sigma公司產品；普魯蘭多糖標準品（P-82）為日本Shodex公司產品；黃嘌呤、次黃嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胞苷、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、鳥苷、肌苷、胸苷、蟲草素（3’-脫氧腺苷）均為美國Sigma公司產品；2’-脫氧鳥苷和2’-脫氧腺苷購自上海生工生物工程有限公司；N6-（2-羥乙基）腺苷由上海市農業科學院食用菌研究所加工技術與發酵工程研究室分離純化，經1H-NMR、13C-NMR和ES-MS鑒定；甲醇（色譜純）為美國Dikma公司產品。

凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光檢測聯用系統由Waters 2695高效液相系統（美國Waters公司）、2414示差折光檢測器（美國Waters公司）、DAWN 8+激光檢測器（美國Wyatt公司），Waters 2998紫外檢測器（美國Waters公司）組成。Waters 1525高效液相色譜儀配Waters 2489紫外檢測器和Waters 2707自動進樣器（美國Waters公司）；ICS-2500型高效離子色譜儀（美國Dionex公司）；L-8900氨基酸自動分析儀（日本Hitachi公司）；KQ-600B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PURELAB ULTRA純水制備儀（英國Elga公司）。

1.3 蛹蟲草的培養

菌種制作：菌株在PDA斜面培養基上活化后，接種于PDB培養基中（50 mL PDB培養基裝于150 mL三角瓶），150 r/min、25℃下培養4 d，獲得所需要的生產菌種。固體培養子實體：20 g麥仁，33 mL水裝入玻璃培養瓶中（直徑6.8 cm，高10.5 cm），高壓滅菌25 min，冷卻后接種，瓶蓋中墊上濾紙，在保證透氣的同時避免空氣交換可能引發的污染，于25℃暗培養3—4 d，當觀察到菌絲已明顯在培養基表面開始蔓延時，轉至光培養，光照強度控制在500 lx左右，培養溫度調至22℃，培養17 d左右，子實體原基開始出現，45 d左右子實體成熟并長滿全瓶時收獲。

液體發酵菌絲體：50 mL PDB培養基裝于150 mL三角瓶，接入液體菌種，150 r/min、25℃下培養4 d。過濾收集菌絲體，用蒸餾水清洗后備用。

蛹蟲草子實體和菌絲體分別于60℃干燥后經粉碎機粉碎，備用。

1.4 多糖測定

參考文獻［18］的方法提取蛹蟲草多糖并測定多糖含量。參考文獻［19］的方法測定單糖組成。用凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光檢測儀聯用分析多糖的HPSEC圖譜，考察多糖的分子質量分布情況［20］。色譜條件：色譜柱為TSK-GEL G6000PWXL串聯TSK-GEL G4000PWXL；2414示差折光檢測器（美國Waters公司），DAWN 8+激光檢測器（美國Wyatt公司）；流動相為0.15 mol/L的NaNO3和0.05 mol/L的NaH2PO4·2H2O（pH 7.0），流速0.5 mol/L，上樣量100μL。用ASTRA 6.1計算分子質量，以5 mg/mL的普魯蘭多糖標準品進行校正，多糖在溶液中的折光指數增量（dn/dc）按照0.146 mL/g計算。每個樣品2次重復。

1.5 核苷類成分測定

采用高效液相色譜測定核苷類成分［20］。色譜條件：色譜柱Venusil MP C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）（中國Agela Technologies公司）；流動相：水（A相）-甲醇（B相）；流速：1 mL/min；洗脫程序為0—5 min：100%A，5—10 min，95%A，10—30 min：70%A，30—40 min：95%A，40—45 min：100%A；UV檢測器檢測，檢測波長：254 nm；柱溫：40℃；進樣量：10μL。每個樣品3次重復。

1.6 游離糖醇及小分子糖類成分測定

采用高效陰離子色譜測定游離糖醇及小分子糖類成分［20］。色譜條件：CarboPac MA1陰離子交換柱（4 mm×250 mm）（美國Dionex公司），流動相為480 mmol/L NaOH，流速0.40 mL/min，上樣量25μL，柱溫30℃。每個樣品3次重復。

1.7 氨基酸測定

樣品委托上海交通大學分析測試中心根據GB/T 5009.124—2003測定氨基酸組成，氨基酸測定方法參考文獻［21］。

2 結果與分析

2.1 多糖

表1為相同蛹蟲草菌株獲得的子實體和菌絲體中多糖含量和其單糖組成及摩爾分數。經苯酚硫酸法測定蛹蟲草菌絲體中多糖含量比子實體高25.1%。兩種培養方式得到的子實體和菌絲體中多糖的單糖組成中均由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，但組成比例有差異，子實體多糖的單糖組成中葡萄糖所占摩爾分數最高為67.87%，其他單糖所占摩爾分數為2.75%—17.18%，而菌絲體中葡萄糖所占摩爾分數最高為37.87%，其次為甘露糖占33.22%、半乳糖占26.91%。

表1 多糖含量和單糖組成比較Table 1 Com parison of polysaccharide content and monosaccharide com position %

對多糖的分子質量分布圖譜進行測定可以反映不同樣品間的多糖差異。用多角度激光光散射儀測定聚合物和蛋白質等生物高聚物的絕對分子質量，無需進行任何色譜柱標定和對照品參考，分子質量測定范圍廣，可檢測獲得數均和重均分子質量。對培養獲得的子實體和菌絲體中多糖進行HPSEC-MALLSRI聯用分析，其HPSEC圖譜見圖1。根據HPSEC圖譜上的出峰情況和紫外吸收情況，經檢測0—44 min無紫外吸收，44 min后在280 nm波長下有明顯的紫外吸收峰，說明44 min后出峰的組分中混有蛋白類物質，因此將圖譜上的多糖分為3個組分，多糖各組分的分子質量分布特征見表2，其中蛹蟲草子實體的多糖主要在Fraction 1和Fraction 2這兩個組分，其重均分子質量Mw為1.702×106—4.092×107g/mol，多分散系數（Mw/Mn）為1.185—1.619，說明這兩個組分的Mw分布范圍窄，而菌絲體的多糖主要在Fraction 3組分中，其重均分子質量為1.105×105g/mol。

圖1 多糖的HPSEC圖譜比較Fig.1 Comparison of high-performance size exclusion chromatography profile of polysaccharides

表2 多糖分子質量分布特征的比較Table 2 Comparison ofmolecular characterizations of polysaccharides

2.2 核苷

用HPLC對核苷類成分進行分析，其HPLC圖譜見圖2，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版”軟件分析固體培養和液體培養獲得的子實體和菌絲體中核苷類成分HPLC圖譜的相似度。結果表明，子實體和菌絲體中均含有多種核苷類成分，HPLC圖譜的相似度為0.886。HPLC圖譜表明，固體培養子實體中尿苷、鳥苷、腺苷、蟲草素及N6-（2-羥乙基）腺苷的峰較高，為主要的核苷類成分，而液體培養菌絲體中主要的核苷類成分是尿苷、鳥苷、腺苷、蟲草素。各核苷類成分含量見表3，子實體和菌絲體中腺苷含量無顯著差異，但子實體中的蟲草素和N6-（2-羥乙基）腺苷含量與菌絲體差異顯著。

圖2 核苷類成分HPLC色譜圖比較Fig.2 Comparison of HPLC chromatography profiles of nucleosides

表3 核苷類成分的含量比較Table 3 Com parison of nucleoside contents mg·g-1

2.3 游離糖醇及小分子糖類成分

甘露醇也是蟲草類真菌中的有效成分之一，具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、鎮喘祛痰、抗自由基等藥理作用，并且對多種疾病有一定的療效［22］。研究表明，除甘露醇外，蛹蟲草中還含有其他糖醇及游離的單糖、寡糖，它們不僅是有機體的組成和代謝產物，也是化學工業、商業和醫藥上的重要物質。由表4可知，蛹蟲草菌絲體中甘露醇較高，但沒有海藻糖，而子實體中海藻糖含量高達20.07%。

表4 游離糖醇、小分子糖類含量比較Table 4 Comparison of contents of free alditol and low molecular weight sugar %

2.4 氨基酸

由表5可見，蛹蟲草子實體和菌絲體中均含有豐富的氨基酸，與子實體相比，菌絲體的必需氨基酸總量高17.1%，且必需氨基酸與非必需氨基酸的比值、必需氨基酸與氨基酸總量的比值較為理想，分別為0.62和0.38，接近FAO/WHO提出的理想蛋白質必需氨基酸（E%）應達總量40%左右以及E/N值應在0.6以上的要求［23］。

表5 氨基酸含量比較Table 5 Comparison of am ino acid contents

3 討論

固體培養子實體比液體深層發酵經歷的生理過程復雜，且周期長。液體發酵具有發菌速度快（周期短）、生產效率高并且成本低、污染率低等優點，發酵的液體培養基中會產生大量具有經濟價值的菌絲體。雖然目前市場上蛹蟲草的產品形式為固體培養得到子實體，但蛹蟲草菌絲體也具有很高的開發和應用價值。本研究比較相同菌株通過固體培養獲得的子實體和液體培養獲得的菌絲體之間多糖、核苷、游離糖醇及小分子糖類、氨基酸組成方面的差別，發現子實體和菌絲體中這些活性成分有所差異，說明子實體和菌絲體的生物活性也不盡相同，在今后應用上也應區別對待，對蛹蟲草是否可以作為子實體的替代品仍需做大量的研究工作。蛹蟲草菌絲體雖然在多糖含量上高于子實體，但其單糖組成的摩爾分數及多糖分子質量分布不同。由于多糖的活性與其結構和分子質量有密切關系［23-24］，因此需要對蛹蟲草子實體和菌絲體中的多糖進一步分離純化并對其生物活性進行研究，為今后蛹蟲草多糖產品的開發應用奠定基礎。蛹蟲草子實體或發酵菌絲中核苷類化合物種類較多，蟲草素是蟲草屬真菌中特有成分，該成分具有抗腫瘤、抗炎、免疫調節等多種生物活性［25］，是蛹蟲草中發揮藥理作用的主要活性成分之一。除蟲草素外，蛹蟲草中的另一種核苷類成分N6-（2-羥乙基）-腺苷，具有較好的鎮痛、Ca2+拮抗、抗腫瘤作用［26-27］，它在蛹蟲草子實體中的含量也較高，但在菌絲體中的含量很低，因此如果今后針對蛹蟲草中N6-（2-羥乙基）-腺苷這一成分進行分離純化和活性研究應選擇蛹蟲草子實體為原料。海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環境條件下細胞表面能形成獨特的保護膜，有效保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。這一獨特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物制品的優良活性保護劑以外，還是保持細胞活性、保濕類化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料［28］。蛹蟲草子實體中海藻糖含量高達20.07%，這為蛹蟲草開發相關功能產品提供了有利的物質基礎，而蛹蟲草發酵菌絲體中游離糖醇組成和子實體不同，且其中甘露醇含量遠遠高于子實體中的，這其中的代謝轉化都值得深入研究。此外，本研究中對蛹蟲草子實體和菌絲體多糖的HPSEC圖譜、核苷類成分HPLC圖譜和游離糖醇小分子糖類成分的分析結果也可為今后蛹蟲草兩種不同產品形式的辨別提供一定的科學依據。