鱘形目魚類染色體研究現狀及進展

曾慶凱，杜合軍，楊 菁

( 1.三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443100；2.中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所，湖北 宜昌 443100 )

染色質是真核生物遺傳物質的載體，在細胞分裂過程中，核內染色質凝縮呈線狀，對堿性染料較為敏感，此時稱其為染色體[1]。對染色體玻片標本和染色體照片進行對比分析，并根據各染色體的長度、著絲點位置、臂比、隨體有無等形態特征進行觀測、描述和分組，確定其染色體組型，是染色體研究的基本方式。此外，通過不同的顯帶方式對染色體形態結構進行對比分析，也是常用的染色體研究方法。染色體研究有助于探明生物遺傳組成、遺傳變異規律和發育機制，染色體研究結果對真核生物雜交育種、多倍體育種、性別遺傳機理、基因組數、物種起源與進化和種族關系鑒定等具有一定的參考價值[2]。

鱘形目魚類，隸屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、軟骨硬鱗下綱，是一個古老的生物類群，在距今2億年的白堊紀晚期，它們便生活在地球上，在脊椎動物遺傳與進化學研究中具有重要價值[3]。鱘形目魚類現存2科6屬27種，全部分布于北半球的大型河流，咸、淡水湖泊及海水水域[4]。近年來，受到過度捕撈、偷獵、洄游受阻、產卵棲息地喪失、水質惡化、餌料匱乏等方面的影響，野生鱘形目中很多種類正瀕臨滅絕[5-6]。27種鱘魚中有18種被認為是極度瀕危物種，2種為瀕危物種，3種為易危物種，其他為近危物種或無危物種，其中野生白鱘(Psephurusgladius)自2003年之后再未見報道[7]。因此，針對鱘形目魚類開展各項保護和研究工作變得極為迫切。筆者主要針對鱘魚染色體的研究概況進行介紹，以期對鱘魚保護和研究工作起到一定的積極作用。

1 鱘魚染色體標本制備及其染色體數目

隨著細胞低滲處理技術和氣干法在染色體制備中得到應用，中期分裂相細胞的獲取成為了染色體標本制備的關鍵[8]。根據細胞獲取方法的不同，染色體標本制備的方法主要有活體注射法、細胞培養法、胚胎細胞直接制片法、幼魚游泳法等[9-12]。

鱘魚中也有利用活體注射法制作染色體標本的報道，如短吻鱘(Acipenserbrevirostrum)[13]、施氏鱘(A.schrenckii)[14]、小體鱘(A.ruthenus)[15]、匙吻鱘(Polyodonspathula)[16]、阿姆河大擬鏟鱘(Pseudoscaphirhynchuskaufmanni)[17]等。還有早年中華鱘(A.sinensis)核型分析也是采用腎細胞培養的方法完成的[18]。鱘魚作為大型魚類，解剖工作需要耗費大量人力物力，而作為珍稀魚類，應避免減少其種群數目。活體注射法和內臟器官細胞培養法均需對研究對象進行解剖，目前在鱘魚染色體標本制備中已經極少采用。鰭條、皮膚、外周血等組織樣本的采集對魚體的傷害較小，因此使用這些組織樣本進行細胞培養制備染色體是比較適合的方式，現今常用的鱘魚染色體制備方法有鰭條細胞系培養法、外周血淋巴細胞培養法等。

Fontana等[19]研究了達氏鰉(Husodauricus)、高首鱘(A.transmontanus)和西伯利亞鱘(A.baerii)鰭條成纖維細胞系的培養，獲得這3種鱘魚的鰭條成纖維細胞系。利用這些細胞系的制作染色體標本，均獲得了清晰的染色體標本，分析得出西伯利亞鱘的核型為2n=246±10，達氏鰉的核型為2n=120±8，高首鱘為2n=246±10，該結果與已有的報道無顯著性差異[20]。在此基礎上，研究人員對小體鱘[21]、納氏鱘(A.naccarii)[21]、歐洲大西洋鱘(A.sturio)[22]和湖鱘(A.fulvescens)[23]等進行了一系列的染色體相關研究，解析其進化關系、倍型等科學問題，以促進鱘魚細胞遺傳學的研究。

外周血淋巴細胞體外培養是一個極其復雜的過程，不同魚類的外周血淋巴細胞對于培養條件的要求差異較大；同種魚類隨著季節、年齡、性成熟以及生理條件的不同，其淋巴細胞的培養差異巨大。Fujiwara等[24]探討了不同培養基以及不同促淋巴細胞分裂劑對淋巴細胞有絲分裂指數的效應情況，應用于高首鱘染色體標本制備中，并獲得較好的結果。Symonová等[25]在該方法基礎上進行了改進，制作并獲得了分散良好的雜交鱘的染色體標本。Nowruzfashkhami等[26]采用淋巴細胞培養法制作了波斯鱘(A.persicus)的染色體，分析得出其核型為2n=258±4。董穎等[27]以小體鱘為研究對象，對其外周血淋巴細胞體外增殖的培養條件也進行了探討，為鱘魚染色體標本制備提供技術參考。相對鰭條細胞培養而言，外周血淋巴細胞培養的優勢在于花費的時間更短。

鱘形目魚類是一種多倍體起源的魚類，細胞水平的進化有別于其他魚類，其染色體數目眾多，形態多樣。根據染色體數目可將鱘形目魚類分為3類：染色體數目為110～130的A類，染色體數目為220～276的B類以及染色體數目約372的C類[28-29]。其染色體形態多樣，包含了中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體、端著絲粒染色體、近端著絲粒染色體以及點狀的微染色體等類型，并且不同類型染色體存在較為明顯的大小差異[30-31]。

開展鱘魚染色體研究不僅對于鱘魚分類學和系統發生研究有十分重要的意義，而且對于現代分子生物學中的基因定位、原位雜交、種間雜交鑒定和倍型研究等方面也有實際意義[32-33]。然而，由于鱘魚染色體數目多，存在大量的微染色體，目前的研究大都只能給出染色體數目的大概范圍，這使染色體研究面臨極大挑戰，也使鱘魚細胞遺傳學研究難以深入[34]。已報道的部分鱘魚染色體數目統計情況見表1。

2 鱘形目魚類染色體顯帶研究

染色體研究除了對其數目進行研究之外，還可通過不同的顯帶方式對其帶型進行分析。高分辨率顯帶技術能顯示染色體內部結構，提供更多具有鑒定性特征的信息，即顯示染色體的“解剖學”特征，它被廣泛應用于動、植物和人類的染色體研究領域。該方法不僅能指導同源染色體的配對和核型排列，而且能顯示染色體的結構與變化。如染色體的易位、缺失、重復、臂間和臂內倒位，能正確地識別特定染色體，已成為鑒定單個染色體和染色體組、探討物種染色體進化和系統分類等問題的方法和手段之一[32]。

表1 部分鱘形目魚類染色體數目

根據染料及染色方法的不同，染色體顯帶技術包括C顯帶技術、Q顯帶技術、G顯帶技術、R顯帶技術和銀染顯帶技術等。除此之外，熒光染料色霉素A3(CMA3)和4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)也被用于魚類染色體顯帶技術，前者為GC特異性染料，后者為AT特異性染料[52]。運用不同的顯帶方式，鱘形目魚類染色體研究主要包括異染色質區、核仁組織區、AT豐富區以及GC豐富區等方面。

2.1 鱘形目魚類染色體異染色質研究

染色體異染色質主要采用C顯帶技術進行研究[53]。鱘形目魚類中的西伯利亞鱘[33]、閃光鱘[38]、高首鱘[48]、俄羅斯鱘[50]、歐洲鰉[54]、小體鱘[55]等的C顯帶研究均有報道。從各鱘魚的C顯帶結果發現，即使是最小的微染色體，C顯帶也可以將常染色質區和異染色質區清晰地區分開，反之也證明這些微染色體的確屬于染色體，而非雜質[33]。此外，鱘魚的C帶一般只在中型染色體、小型染色體以及微染色體上出現，大型染色體上幾乎未見C帶，只有閃光鱘例外，其大型染色體上可檢測出清晰的C帶，并且出現在其短臂上，而非通常的著絲粒區域[38]。另外俄羅斯鱘的C帶符合鱘魚C帶染色也表現了其特異性，即其中4個中型染色體被完全侵染，表現出完全異質性[50]。根據目前有關鱘魚染色體異染色質的分析報道，有研究人員認為鱘魚染色體核型進化過程符合羅伯遜融合假設，即當兩條近著絲粒染色體在著絲粒或其附近某一部位發生斷裂后，二者的長臂構成一個大的染色體，而其短臂構成一個小的染色體[28,56]。關于該論斷的正確性有待進一步研究論證。

2.2 鱘形目魚類染色體核仁組織區研究

核仁組織區是指核糖體基因在染色體上的分布區域，利用銀染技術可以使核仁組織區特異性著色，從而分析染色體上核仁組織區的特點[57]。Fontana[3]使用銀染技術比較了西伯利亞鱘、納氏鱘、高首鱘和小體鱘的核仁組織區，發現小體鱘的核仁組織區分布在兩對形態不同的同源染色體上，而其他3種鱘魚的核仁組織區分布在兩組四聯體上，根據同源染色體配對原則，推斷小體鱘為二倍體，其他3種鱘為四倍體。短吻鱘染色體銀染顯帶發現10個核仁組織區，被認為是六倍體物種[13]。從以上結果推斷，鱘魚的倍型或許可界定為：A類為二倍體，B類為四倍體，C類為六倍體。推斷結果的準確性還需要更多研究的支持。

有研究認為核仁組織區數目的多少可反映物種的進化程度，核仁組織區越少，其進化程度越低，更有可能為相對原始的物種[58]。基于此觀點，研究人員推測含有3對核仁組織區的歐洲大西洋鱘(2n=120)相對于含有2個核仁組織區的小體鱘(2n=120)和歐洲鰉(2n=120)為較新的物種[22]。在俄羅斯鱘的染色體帶型研究中，有14個核仁組織區被發現，其中4個中型染色體的核仁組織區分布在其雙臂的端粒上，一個中著絲粒染色體的核仁組織區分布在長臂端粒上，4個雙臂染色體和4個端著絲粒染色體的核仁組織區分布在短臂端粒上，另外還有1個大型中著絲粒染色體的核仁組織區也分布在短臂端粒上，推測俄羅斯鱘的染色體在進化過程中發生了易位重排的現象，進一步支持了鱘魚進化的羅伯遜融合假設[50]。

2.3 鱘形目魚類染色體GC和AT豐富區研究

CMA3和DAPI均為能與DNA強力結合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。CMA3和DAPI分別為GC特異性染料和AT特異性染料。目前，已有多種鱘魚采用這兩種染料進行了染色體研究，比如納氏鱘[3]、湖鱘[23]、俄羅斯鱘[50]、歐洲鰉[54]等。DAPI的染色結果顯示，各種類染色體不存在特異性，而CMA3在不同染色體上表現出了不同的染色效果。在俄羅斯鱘中，大多數小型染色體的端粒區域以及亞中著絲粒染色體和中著絲粒染色體的著絲粒或者端粒區域均能檢測到熒光信號；其中4個中型的中著絲粒染色體被完全染色[50]。在歐洲鰉中，大多數小型染色體都顯現CMA3陽性帶，大型染色體中部分近端著絲粒染色體的CMA3陽性帶在近端著絲粒區域，另外還有少部分亞中著絲粒和中著絲粒的其中兩條臂上也有陽性帶[54]。在納氏鱘的染色體研究中，使用CMA3對其染色體進行染色，熒光顯微鏡下觀察發現其中一條中等大小的染色體整體都被染色，而多數小型染色體上僅部分被染色[3]。此外，CMA3還常被用于核仁組織區的研究，但是在鱘魚的研究中發現，GC豐富區與鱘魚核仁組織區之間似乎沒有絕對的聯系，因此鱘魚中很少采用該染料研究核仁組織區[23,50]。

3 鱘形目魚類的熒光原位雜交顯帶研究

熒光原位雜交技術是指細胞學方法與分子雜交技術相結合的產物，是利用熒光標記的核酸片段為探針，與中期細胞的染色體或間期細胞核的DNA雜交，在染色體上或核中顯示與探針同源的DNA片段的位置，從而將這段DNA序列定位在細胞中[59]。此技術應用在染色體鑒定、異常染色體檢測、某些特殊染色體在核中的位置及基因定位等研究領域。由于這項技術定位準確，應用越來越廣泛，在鱘魚染色體研究中也得到廣泛應用。應用于鱘魚熒光原位雜交技術的探針主要有：端粒、核糖體DNA (rDNA)、Hind Ⅲ衛星DNA家族等。

3.1 鱘形目魚類端粒研究

端粒是指染色體末端所特有的帽子片段，重復序列(TTAGGG)n在所有的脊椎動物中高度保守，所有脊椎動物染色體的端粒位置都具有重復序列(TTAGGG)n[60]。通常情況下，正常的染色體均有端粒序列。歐洲大西洋鱘[22]、湖鱘[23]、小體鱘[36]、西伯利亞鱘[36]、納氏鱘[36]、俄羅斯鱘[36]、閃光鱘[38]以及歐洲鰉[54]的染色體端粒序列研究中，所有染色體都能檢測到端粒序列的熒光信號，此結果進一步說明，即使是個體極其微小的微染色體，也具有完整的染色體結構。端粒序列一般位于染色體的體臂末端，但一些特殊的物種在染色體的常染色質或異染色質中也發現端粒信號，如湖鱘[23]和俄羅斯鱘[36]都有兩條染色體被端粒熒光信號完全覆蓋。以下兩種推斷可解釋該現象：其一，認為這兩種鱘魚極有可能發生了染色體重排，它們可能由其他鱘魚進化而來；其二，這兩種鱘魚在染色體間質區域存在與端粒序列類似的重復序列，從而導致被端粒信號完全覆蓋。

3.2 鱘形目魚類核糖體DNA(rDNA)研究

真核生物的rDNA由兩個高度重復的基因家族構成，分別是主rDNA基因簇(18S、5.8S和28S rDNAs)和次rDNA基因簇(5S rDNA)[33]。其中核仁組織區即為主rDNA基因簇區域，在鱘魚染色體研究中，該區域常采用銀染或rDNA探針來檢測。研究發現，采用rDNA探針檢測到的核仁組織區往往比銀染方法要多。如歐洲鰉[54]中，通過銀染發現兩對中型染色體上具有核仁組織區，而28S rDNA探針檢測發現6條染色體具有核仁組織區信號；歐洲大西洋鱘[22]的研究結果與其類似。根據此結果推斷，銀染只能使具有活性的核仁組織區顯色，而28S rDNA不僅能檢測銀染能檢測的活性區域，還能檢測銀染檢測不到的非活性核仁組織區[21,33]。因此，使用rDNA探針研究核仁組織區相比銀染能獲得更全面更精確的定位結果。

rDNA在鱘魚進化關系和染色體倍型研究中得到應用。小體鱘[21]、歐洲大西洋鱘[33]、歐洲鰉[54]這3種A類鱘魚的5S rDNA信號為2，納氏鱘[21]、俄羅斯鱘[33]這兩種B類鱘魚的5S rDNA信號為4。根據同源染色體配對的原則，從5S rDNA信號的數目推斷A類鱘魚屬于二倍體，B類為四倍體。研究發現，短吻鱘5S rDNA的370余條染色體中出現了6個信號，研究人員認為其為6倍體，并推斷短吻鱘可能是由A類鱘魚和B類鱘魚雜交出現的新種[51]。

3.3 鱘形目魚類Hind Ⅲ衛星DNA家族研究

HindⅢ衛星DNA家族是串聯重復的非編碼DNA序列，其主要分布在染色體的異染色質區域，比如著絲粒和端粒區域[62]。有證據表明衛星DNA 與基因組的結構穩定性相關，其在進化過程中具有較高的突變率，是研究物種分類和進化關系的重要工具[63-66]。

鱘魚相關研究中，納氏鱘[67]中首先分離得到了Hind Ⅲ衛星DNA家族，并以此設計熒光原位雜交探針對閃光鱘[38]、西伯利亞鱘、俄羅斯鱘、納氏鱘、小體鱘、歐洲大西洋鱘、高首鱘和歐洲鰉[68]的衛星DNA進行了研究，結果除了歐洲大西洋鱘外，其他鱘魚都有清晰可見的熒光信號。推斷歐洲大西洋鱘極有可能是由其他鱘魚進化產生的物種[69-70]。

4 存在問題與展望

鱘形目魚類染色體數量多，形態復雜，現今的染色體制備方法仍舊無法滿足鱘魚細胞遺傳學的更深入研究。比如，達氏鰉的染色體數目研究存在較大的爭議，早期的達氏鰉核型研究中發現其有120條染色體，而Vasil′ev等[44]研究結果表明，其染色體數目為268±4，但是DNA含量測定結果又更加支持達氏鰉染色體為120條的結果。在無法準確鑒定出染色體數目的情況下，繼續深入開展細胞遺傳學研究，難以評估研究結果的有效性，因此鱘形目魚類染色體標本制備方法的研究仍舊是一個難題。

匙吻鱘鰭條細胞系建立的研究中，研究人員對第9代和第59代傳代細胞進行了染色體分析，顯示第9代的染色體數為2n=120，而第59代的為2n=90，說明染色體在細胞培養至59代出現了大量丟失[71]。研究人員分析了中華鱘第21代傳代細胞，發現71%的細胞染色體數目均低于264，說明傳至21代大部分細胞的染色體出現丟失[47]。細胞系的建立在珍稀瀕危物種的保護中具有重要意義，動物細胞系在傳代過程中染色體數目會發生變化，因此染色體組型的研究對細胞培養過程中遺傳變異的檢測具有重要作用[72]。大部分鱘魚都處于瀕危狀態，進一步開展染色體研究工作，對這些鱘魚在細胞水平的保護具有重要意義。

我國境內已知有8種鱘魚，包括達氏鰉、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、裸腹鱘、中華鱘、達氏鱘和白鱘[73]。關于西伯利亞鱘、小體鱘、裸腹鱘的染色體研究已有較多的報道，而其他幾種鱘魚的染色體研究尚比較缺乏，為了更深入認識鱘形目魚類的進化關系及其在脊椎動物進化中的地位，進一步開展其他幾種瀕危鱘魚的染色體研究是有必要的。此外，已有研究發現人工養殖的庫頁島鱘[43]和西伯利亞鱘[74]存在自發多倍體化的現象。目前對瀕危鱘魚的野生種群的補充大都采用人工養殖放流的方式，有必要對放流群體進行種質鑒定，以避免對野生種群的遺傳結構造成不良的影響。