MHC區(qū)域HLA-B類基因與抗癲癇藥誘發(fā)重癥藥疹的相關(guān)性研究

張祥，儲(chǔ)海峰，胡白，陸聞生

[1 .皖南醫(yī)學(xué)院，蕪湖 241002；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)皮膚性病科]

史蒂文斯-約翰遜綜合征(SJS)、中毒性表皮壞死綜合征(TEN)，剝脫性皮炎型藥疹(ED)及超敏反應(yīng)綜合征(HSS)等嚴(yán)重皮膚藥物不良反應(yīng)(cADRs)嚴(yán)重威脅人類的健康和生命[1]。嚴(yán)重皮膚藥物不良反應(yīng)又稱重癥藥疹，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與變態(tài)反應(yīng)、遺傳等多種因素有關(guān)，其中最常見(jiàn)的誘發(fā)因素是服用抗癲癇藥物。重癥藥疹患者可引起敗血癥和呼吸衰竭，有高達(dá)30%的死亡率[2]，通常被認(rèn)為是不可預(yù)測(cè)的。雖然有研究表明[3-4]攜帶HLA-B*1502等位基因人群服用卡馬西平誘發(fā)SJS和TEN危險(xiǎn)性增加，幾乎達(dá)到100%，而在輕度藥物不良反應(yīng)患者很少攜帶。然而,在一些研究中[5-6]，卡馬西平誘發(fā)的部分SJS和TEN患者卻并未攜帶HLA-B*1502等位基因，這表明除了HLA-B*1502等位基因，攜帶HLA-B其他等位基因也可能誘發(fā)重癥藥疹。目前還不清楚，攜帶HLA-B*1502等位基因人群服用其他抗癲癇藥物如苯巴比妥及拉莫三嗪是否會(huì)出現(xiàn)重癥藥疹。本研究主要通過(guò)測(cè)定服用抗癲癇藥物的重癥藥疹患者外周血相關(guān)HLA-B等位基因，探討HLA-B等位基因與重癥藥疹的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 耐受組成員之間與病例組成員之間均無(wú)血緣關(guān)系。

病例組：選自安徽省立醫(yī)院2014年5月至2018年6月入住皮膚科及相關(guān)科室病房，確診的史蒂文斯約翰遜綜合征、中毒性表皮壞死綜合征，史蒂文斯約翰遜綜合征-中毒性表皮壞死綜合征重疊型患者，診斷參照第8版《皮膚性病學(xué)》[7]，共25例。患者除服用抗癲癇藥12周內(nèi)未服用其他藥物，患者之間沒(méi)有血緣關(guān)系，都在疾病的急性期，并有典型的皮損表現(xiàn)。男9例，女16例；年齡范圍14～81歲，年齡(49.8±7.6)歲。所有患者對(duì)研究?jī)?nèi)容具有知情權(quán)并簽署知情同意書(shū)。

耐受對(duì)照組：耐受對(duì)照來(lái)自安徽省立醫(yī)院神經(jīng)外科、神經(jīng)內(nèi)科服用卡馬西平、苯巴比妥和拉莫三秦3個(gè)月內(nèi)未引起藥疹的住院患者，共50例。年齡、性別與病例組相匹配[男19例，女31例；年齡范圍29～78歲，年齡(51.5±9.7)歲]。

1.2 研究方法 標(biāo)本采集:從病例組和耐受對(duì)照組采集外周靜脈血2～5 mL于EDTAK3抗凝管中，稍放置后置于離心機(jī)中離心(3000 r/min，3 min)，將血清提取至凍存管中，然后存放于-80 ℃冰箱，血細(xì)胞留置在管中存放于4 ℃冰箱備用。

DNA提取: DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn))。

引物設(shè)計(jì)與合成: 通過(guò)查閱文獻(xiàn)，本研究選取了5個(gè)與免疫性疾病相關(guān)性較高的HLA-B等位基因，分別如下：HLA-B*15:02、-B*40:01、-B*58:01、-B*13:01和HLA-B*38:02，采用PCR-特異性引物(PCR-SSP)方法進(jìn)行分型。HLA-B基因擴(kuò)增的引物序列參考文獻(xiàn)中的序列[8]。

結(jié)果判斷以及質(zhì)控: PCR反應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(測(cè)序確定是同一亞型的樣本)與陰性對(duì)照(不加DNA模板)，且每一個(gè)反應(yīng)孔均添加一對(duì)保守的內(nèi)參引物。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照正常出現(xiàn)、陰性對(duì)照表現(xiàn)為陰性時(shí)，若僅出現(xiàn)內(nèi)參照帶則為陰性，內(nèi)參照帶及目的條帶都出現(xiàn)則為陽(yáng)性，只有目的條帶出現(xiàn)也為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過(guò)PLINK 1.07軟件分析比較兩組的等位基因頻率，比較各組的P值、相對(duì)危險(xiǎn)度用優(yōu)勢(shì)比(OR值)、95%置信區(qū)間(95%CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的臨床特征 總共25例患者被收集(男性占36%)，重癥藥疹發(fā)病的年齡是(49.8±7.6)歲(范圍14～81歲)，其中14例是由于服用卡馬西平，11例服用其他抗癲癇藥誘發(fā)(其中包括5例苯巴比妥和6例拉莫三嗪)。25例患者完成了基因分型，50例服用抗癲癇藥物未出現(xiàn)藥疹的人群被作為耐受對(duì)照組，他們的年齡是(51.5±9.7)歲(范圍29～78歲)，男性占38%。

2.2 HLA-B等位基因分型結(jié)果 病例組與耐受對(duì)照組分型結(jié)果見(jiàn)表1,2。在病例組中最常見(jiàn)的等位基因頻率為HLA-B*1502(64%)，HLA-B*13:01 (12%),和 HLA-B*38:02 (8%)。而在耐受對(duì)照組最常見(jiàn)的等位基因頻率為HLA-B*40:01 (32%),HLA-B*58:01 (18%) 和HLA-B*15:02(14%)。總的來(lái)說(shuō)，病例組攜帶HLA-B*1502等位基因要顯著高于耐受對(duì)照組(P=9.6×10-6，OR=10.92，95%CI:3.07～41.00)。HLA-B*1502攜帶率，很大程度是由卡馬西平引起，服用卡馬西平誘發(fā)重癥藥疹的患者相比服用卡馬西平耐受組攜帶HLA-B*1502攜帶率顯著高(P=7.0×10-6，OR=36，95%CI:4.65～375.97),這種HLA-B*1502攜帶率增高趨勢(shì)在苯巴比妥誘發(fā)重癥藥疹患者也存在(P=0.013，OR=45，95%CI=1.47～7827.55)，但在拉莫三嗪組沒(méi)有相關(guān)性(P=0.879，OR=0.33，95%CI=0.01-8.01)。病例組攜帶HLA-B*40:01等位基因低于耐受對(duì)照組(P=0.045，OR=0.18， 95%CI：0.03～0.97)。

表1 兩組HLA-B各等位基因的情況

表2 服用不同抗癲癇藥物在病例組與耐受對(duì)照組中的HLA-B*15:02等位基因分布

3 討論

關(guān)于重癥藥疹的病因及發(fā)病機(jī)制已有許多文獻(xiàn)述及，目前免疫學(xué)說(shuō)是研究熱點(diǎn)[9]。人類白細(xì)胞抗原(HLA)，是由一系列緊密連鎖的基因座位所組成的具有高度多態(tài)性的復(fù)合遺傳系統(tǒng)，每一個(gè)基因座位都有很多共顯性等位基因。HLA不但在免疫反應(yīng)中起重要的作用，而且還具有單倍體遺傳、高度多態(tài)性、連鎖不平衡性等遺傳特征。

本研究通過(guò)PCR-SSP的方法對(duì)HLA-B等位基因進(jìn)行分型，采用病例對(duì)照研究分析了這些HLA-B等位基因與重癥藥疹發(fā)病的相關(guān)性。對(duì)于多等位基因比較采用bonferi校正P值的方法,以減少多重比較引起的誤差導(dǎo)致的假陽(yáng)性。為了反映關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度,同時(shí)計(jì)算了OR值及可信區(qū)間,OR值指某事物發(fā)生與不發(fā)生的概率之比,可以反映某因素與疾病的關(guān)聯(lián)程度,如小于1,則該因素與疾病成負(fù)相關(guān),如大于1,則該因素與疾病成正相關(guān),值越大,說(shuō)明關(guān)聯(lián)的程度越強(qiáng)。

通過(guò)HLA-B基因分型，本組證實(shí)了前期相關(guān)研究結(jié)果，HLA-B*1502與抗癲癇藥物誘發(fā)的重癥藥疹有相關(guān)性。本組發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性主要與卡馬西平密切相關(guān)，這與中國(guó)臺(tái)灣相關(guān)研究[10]結(jié)果相似。本組研究結(jié)果進(jìn)一步支持HLA-B*1502應(yīng)該作為一個(gè)藥物基因生物標(biāo)志，在服用卡馬西平之前應(yīng)該接受該等位基因檢測(cè)，從而避免攜帶該等位基因人群服用卡馬西平發(fā)生重癥藥疹。抗癲癇藥物中出現(xiàn)交叉反應(yīng)是很常見(jiàn)的現(xiàn)象。在相關(guān)的研究表明苯巴比妥和拉莫三嗪與重癥藥疹具有相關(guān)性，但結(jié)果并不一致，這可能與研究的患者數(shù)量小有關(guān)，需要Meta分析進(jìn)一步證實(shí)[11-12]。最近對(duì)卡馬西平及有類似結(jié)構(gòu)的藥物體外實(shí)驗(yàn)表明，卡馬西平與HLA-B*1502之間的相互作用及對(duì)T細(xì)胞的刺激5-羧氨基起著至關(guān)重要的作用。雖然抗癲癇藥物都具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，但拉莫三嗪和 苯巴比妥都不具有羧基，而丙戊酸鈉和加巴噴丁不具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)。這些抗癲癇藥物之間結(jié)構(gòu)的差異可以很好地解釋HLA-B*1502與嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)發(fā)生在不同的抗癲癇藥的差異。除了HLA-B*1502外，HLA-B*1508在印度人群[13]，HLA-B*1511、 HLA-B*1518在日本人群[14-15]，也有報(bào)道[16]HLA-B*1521與卡馬西平引起的SJS和TEN有相關(guān)性。這種現(xiàn)象可能是與HLA-B*1502相似的氨基酸序列的同源性可能引發(fā)類似嚴(yán)重藥物反應(yīng)[17]。有幾項(xiàng)研究也表明某些HLA等位基因?qū)R西平誘發(fā)重癥藥疹具有保護(hù)作用，與卡馬西平耐受對(duì)照組相比，在病例組攜帶頻率較低，這其中包括HLA-B*40:01。一種HLA等位基因可能會(huì)增加由一種藥物引起的嚴(yán)重藥物反應(yīng)，卻會(huì)降低其他藥物引起相同表型嚴(yán)重藥物反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[18]。最近全基因組關(guān)聯(lián)研究表明等位基因變異、Th1/ Th2平衡關(guān)系，相關(guān)炎性反應(yīng)在哮喘和自身免疫疾病存在相反的基因關(guān)聯(lián)方向。對(duì)HLA等位基因與嚴(yán)重藥物反應(yīng)的分析可以進(jìn)一步揭示某種藥物與HLA等位基因分子結(jié)合改變了抗原形狀和化學(xué)性質(zhì)的變化，從而改變抗原性和誘發(fā)T細(xì)胞激活。可以想象相同的HLA分子與不同藥物的相互作用，對(duì)下游的肽鏈會(huì)產(chǎn)生不同的影響。這一發(fā)現(xiàn)也表明，除了HLA等位基因外，其他因素可能與嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。T細(xì)胞受體(TCR)的大量克隆增殖表明了其對(duì)嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)發(fā)生機(jī)制起重要作用。值得進(jìn)一步研究的是，同樣或者不同的TCR克隆類型是否會(huì)由其他藥物誘發(fā)重癥藥疹個(gè)體中發(fā)現(xiàn)。

總之，HLA-B*1502與卡馬西平誘發(fā)的重癥藥疹有緊密的聯(lián)系。可能的保護(hù)因素HLA-B*40:01與重癥藥疹相關(guān)性需要進(jìn)一步調(diào)查。