黃瓜灰霉病的生防木霉菌株篩選

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；中國農科院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081)

郭玉杰，呂恒，牛永春，鄧暉

(中國農科院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081)

師迎春

(北京市植物保護站，北京 100029)

余知和

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

黃瓜(Cucumissativus)是我國的主要蔬菜作物之一，栽培面積已達125.3萬公頃，占全國蔬菜面積的10%左右，產量一直居世界首位[1]。灰霉病是一種由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)侵染所引起的常見植物真菌病害。灰葡萄孢菌寄主范圍廣，可侵染包括黃瓜在內的200余種蔬菜、花卉和果樹等植物[2]。研究表明，灰霉病原菌分生孢子在適宜的濕度、溫度條件下容易快速萌發，在宿主植株殘葉、殘枝或其他抵抗力衰弱的表皮、器官等部位直接穿透植株表皮侵入宿主植株，可導致寄主植株枯萎、幼苗爛根、插枝腐爛和莖稈壞疽等癥狀發生[3, 4]。灰葡萄孢菌通過氣流、水分以及人為農事操作等方式傳播蔓延，植物生長發育期內發病的農作物花瓣、葉片和果實上產生的病原菌分生孢子落在健康植物的葉片、莖蔓和果實上也可引起重復感染發病[5]。灰霉病發生嚴重降低農作物的產量和品質，造成農作物減產達30%以上，在農作物果實期，灰霉病發生導致的危害更大，嚴重影響農作物產量及農業的總體產值[6]。

目前，黃瓜生產上缺少有效的抗病品種，黃瓜灰霉病防治主要依賴化學手段。隨著用藥次數增多、藥劑用量增大，病原菌的抗藥群體逐漸增加，灰霉病防治效果逐年下降。大量使用化學農藥也造成果實農藥殘留和環境污染等嚴重問題。因此，尋找新的防治途徑以克服農藥殘留和病原菌的抗藥性問題，已成為黃瓜種植生產上的當務之急[7]。近年來，關于植物病害生物防治國內外已有許多報道，但對于葉部和果實病害生物防治的報道僅限于少數幾種病害，主要是由于葉部和果實生物防治菌防效更易受環境因素影響。該研究旨在篩選對黃瓜灰霉病有高效拮抗作用的真菌菌株，從而為黃瓜灰霉病的生物防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

黃瓜灰霉病菌(灰葡萄孢)菌株ACCC36042由中國農業微生物菌種保藏管理中心提供，用于平板對峙試驗；灰葡萄孢菌株ACCC 36042-2-3由黃瓜灰霉病菌ACCC36042接種黃瓜發病后再分離獲得，用于非揮發性物質抑病試驗和黃瓜葉片、果實的抑病功能試驗。247個木霉(Trichodermaspp.)菌株由中國農科院農業資源與農業區劃研究所牛永春研究員課題組前期從北京郊區食用菌菌棒分離并保藏。

1.2 供試黃瓜

葉片接種試驗用津研2號黃瓜品種；果實接種試驗所用黃瓜從北京市當地市場購買。

1.3 木霉菌株與黃瓜灰霉病菌對峙試驗

分別于25℃活化培養供試黃瓜灰霉病菌菌株ACCC36042與分離保藏的247個木霉菌株3～7d，用打孔器取菌落邊緣直徑5mm菌餅。在直徑9cm的PDA平板距兩側邊緣15mm的位置對稱接種供試病原真菌和木霉菌餅，對照設置單點接種(CK1)和兩點接種病原真菌(CK2)2種對照，每個處理重復3次。培養皿置于25℃黑暗培養3d后調查病原菌落半徑，計算拮抗指數(Antagonism Index, AI)[8]。

每組平板對峙試驗時，當CK2兩點接種病原真菌的菌落接近接觸時進行調查，且處理組病原真菌指向木霉真菌的菌落半徑數值小于CK2平板上相應位置上病原真菌的菌落半徑數值時，視為此菌株有初步的抑菌效果。連續30d觀察木霉與病原真菌的相互作用，將拮抗現象劃分為4種互作類型：覆蓋(A)，木霉菌落覆蓋病原真菌菌落；被覆蓋(B)，病原真菌菌落覆蓋木霉菌落；僵持(C)，木霉和病原真菌的菌落接觸時生長均受阻；抑菌帶(D)，在相互作用區域形成透明的條帶[9, 10]。

1.4 木霉菌株與黃瓜灰霉病菌的非揮發性物質抑菌試驗

將玻璃紙剪成9cm直徑培養皿底能夠平鋪的大小，放入密閉容器中加入無菌水121℃滅菌30min，隔1d滅菌1次，共滅菌3次。取活化的木霉菌落邊緣直徑5mm菌餅接種于已滅菌玻璃紙覆蓋的9cm直徑的PDA平板中央，對照在平板中央接種直徑5mm的圓形PDA培養基，待菌落接近長滿平板時同時移除對照和處理平板上的玻璃紙和接種物；然后在處理和對照平板中央接種已活化培養2d的直徑5mm的黃瓜灰霉病菌ACCC 36042-2-3的菌餅，培養3d后調查黃瓜灰霉病菌的菌落生長情況。每個處理重復3個平板，采用十字交叉法測量并記錄對照和處理灰葡萄孢的菌落直徑，計算抑菌率[11]。

1.5 木霉菌株孢子懸液制備

制備方法參照文獻[12]。將木霉菌株培養5～10個平板，取5～10mL無菌水加入每個平板中，用刮鏟輕輕刮取平板上的木霉孢子經過2層紗布過濾至150mL已滅菌三角瓶中得到原液，用原液配制108孢子/mL的孢子懸浮液100mL，其中加入吐溫80使其終濃度為0.1%。

1.6 離體黃瓜葉片和果實的抑病試驗

供試津研2號黃瓜種子用4%次氯酸鈉溶液消毒3min后用無菌水清洗3次，放入墊有2層濾紙的玻璃培養皿，置25℃培養箱中催芽。待胚根長至0.5cm左右時，將種子播于500mL紙杯內，基質為育苗基質+自然土(體積比2∶1)。每缽定苗1株，20～25℃溫室內育苗。待幼苗長至真葉期時用剪刀剪取帶葉柄的葉片，放入無菌的內有濕潤濾紙的玻璃培養皿內，接種病原真菌后24h在葉片上噴灑木霉孢子液，黃瓜灰霉病原菌接種采用不刺傷貼菌柄方法[13]。

將市場購買的黃瓜果實用無菌脫脂棉擦拭表面后晾干，在自然朝上的位置用黑色記號筆畫6mm左右圓圈。用噴霧器均勻噴灑含0.1%吐溫80的108孢子/mL的木霉孢子懸浮液于黃瓜果實上[14]，然后將脫脂棉放入含有0.1%吐溫80的108孢子/mL的木霉孢子液中浸濕，放在黃瓜果實上標記黑色圓圈處，用保鮮膜包住，24h后揭掉保鮮膜，自然風干后，在標記黑色圓圈處接種黃瓜灰霉病原菌餅，每株木霉在每根黃瓜上3個不同位置放置病原菌餅，黃瓜灰霉病菌接種采用不刺傷貼菌柄的方法[13]。

1.7 基因組DNA提取

將待鑒定菌株接種到直徑6cm的PDA平板25℃培養3d，待菌落長滿整個培養皿，用無菌鑰勺刮取菌絲轉移至2mL離心管，然后用磁珠純化系統提取菌株基因組DNA。具體的研磨、水浴、離心、抽提等步驟參考文獻[15]。

1.8 PCR擴增與序列分析

研究發現，rDNA ITS序列片段分辨率較低[16]，蛋白編碼基因TEF1-α和RPB2等能充分揭示木霉屬內種間關系[17, 18]。

以提取的基因組DNA為模板，分別選取引物對ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)與ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)[19]，TEF1-728F(5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’)與TEF1LLErev(5’-AACTTGCAGGCAATGTGG-3’)[20]，fRPB2-5f[5’-GA(T/C)GA(T/C)(A/C)G(A/T)GATCA(T/C)TT(T/C)GG-3’]和fRPB2-7cR[5’-CCCAT(A/G)GCTTG(T/C)TT(A/G)CCCAT-3’]擴增ITS、TEF1-α和RPB2基因片段[21]。PCR反應體系和反應程序如表1和表2所示。

表1 PCR反應體系組成(50μL)

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳(100V，20min)、染色檢測，送交三博測序公司進行序列測定。本研究先進行rDNA ITS序列比對和分析，將木霉菌株鑒定到相近的組(clade)[22]；對于有功能的木霉菌株采用PAUP v4.0b10軟件構建TEF1-α和RPB2基因序列系統發育樹[23]。

表2 PCR反應程序

注：步驟2～4循環次數ITS為35次，RPB2為36次，TEF1-α為40次；“∞”表示任意時間。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

供試的247株木霉與灰葡萄孢菌株經兩點對峙培養，結果表明，拮抗指數≥30%的木霉菌株有217株，拮抗指數小于30%的木霉菌株有30株，其中69株木霉的拮抗指數大于80%。拮抗木霉與病原真菌的相互作用類型主要是覆蓋病原菌，少部分拮抗菌株與灰霉菌對峙培養中產生明顯的抑菌帶(見圖1)。

左圖：A培養皿接種灰葡萄孢菌；B培養皿左側接種灰葡萄孢菌，右側接種M13033-1，示木霉菌株覆蓋病原菌；右圖：A培養皿接種灰葡萄孢菌；B培養皿左側接種灰葡萄孢菌，右側接種M13033-1，示木霉菌株與病原菌對峙培養中產生明顯的抑菌帶。圖1 木霉菌株M13033-1與灰葡萄孢菌對峙培養情形

2.2 拮抗菌株的非揮發性物質的篩選

注：A為對照，接種灰霉病菌；B為接種木霉菌株M12004 3d后揭開玻璃紙再接種灰霉病菌。 圖2 木霉菌株M12004非揮發性物質的抑菌效果

注：A為對照，接種灰霉病菌；B為先噴灑M13033-1 木霉孢子懸浮液再接種灰霉病菌。 圖3 木霉菌株M13033-1對黃瓜離體葉片的抑病效果

從對峙培養抑菌率80%以上的69株木霉菌株中選擇29株經過玻璃紙非揮發性物質驗證試驗篩選，其抑菌率小于30%的有2株，抑菌率大于30%小于50%的木霉菌株有5株，大于50%小于80%的木霉菌株有10株，大于80%的木霉菌株有12株。在大于80%的木霉菌株中，部分木霉菌株抑菌率可達100%。進一步研究發現，兩點對峙培養抑菌效果好的木霉菌株，在非揮發性物質抑菌試驗中的抑菌效果表現一致。其中，接種木霉菌株M12004在3d后揭開玻璃紙再接種灰霉菌餅，平板上灰霉菌幾乎不長，說明木霉產生的非揮發性物質抑制了灰霉病菌的生長(見圖2)；接種木霉菌株M13033-1在3d后揭開玻璃紙再接種灰霉菌餅，因木霉菌落生長快，從邊緣向中心完全覆蓋了灰霉病菌的菌落，平板上的灰霉菌落直徑比對照接種PDA培養基后再接種灰霉病菌的菌落明顯小，菌株M13033-1產生的非揮發性物質也抑制了灰霉病菌的生長。

2.3 黃瓜離體葉片的抑病效果

在對峙培養和非揮發性物質抑菌試驗基礎上，選擇9株木霉菌株與灰霉病原繼續進行離體黃瓜葉片測試，結果表明，菌株M13033-1的黃瓜離體葉片抑菌效果明顯(見圖3)，抑菌率達60%以上。

注：上黃瓜為對照，接種灰霉病菌后第5天；下黃瓜為先噴M13033-1 木霉孢子液再接種灰霉病菌后第5天。 圖4 菌株M13033-1處理黃瓜果實5d后發病情況

2.4 黃瓜離體果實的抑病效果

將黃瓜離體葉片驗證的抑菌效果好且穩定的木霉菌株M13033-1進一步進行離體果實試驗，結果顯示菌株M13033-1的抑菌效果明顯(見圖4)，抑菌率達80%以上。

2.5 拮抗菌株的分子鑒定

木霉菌株M13033-1的rDNA ITS 序列在GenBank中比對結果屬于木霉屬哈茨組(harzianum clade)。菌株M13033-1和木霉屬哈茨組相近種的模式菌株共8株，以TrichodermaaggressivumCBS100525為外群，使用PAUP v4.0b10軟件分別基于RPB2和TEF1-α基因序列構建了系統發育樹。基于RPB2基因序列構建的系統發育樹得到的3棵MP樹拓撲結構相似(參數如下：tree length=132、consistency index=0.818、homoplasy index=0.182、retention index=0.747、rescaled consistency index=0.611)，圖5為其中一棵系統樹。圖6為基于TEF1-α基因序列構建的系統發育樹得到的一棵MP樹(參數如下：tree length=164、consistency index=0.829、homoplasy index=0.171、retention index=0.731、rescaled consistency index=0.606)。

系統發育樹中菌株M13033-1與Trichodermaafroharzianum以100%的支持率聚類在一起，結果表明M13033-1為Trichodermaafroharzianum(非洲哈慈木霉)(圖5、圖6)。

圖5 基于RPB2基因構建的木霉屬部分種的系統發育樹 圖6 基于TEF1-α基因構建的木霉屬部分種的系統發育樹

3 討論與結論

目前用于灰霉病的生防微生物至少有20余種，其中，以木霉為主要研究對象，對10余種水果、蔬菜上發生的灰霉病害有防治作用，且防治效果不盡相同[24, 25]。這些研究結果表明，生防真菌能夠有效侵染灰霉病病原菌的菌絲，使得灰葡萄孢菌生長受阻，灰霉病病情得到抑制。同時，生防真菌可能通過改變蛋白質、可溶性糖類和維生素等物質來增強植物抗病性。另外，有報道寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)、纏器腐霉(Pythiumperiplcum)及螺卷毛殼(Chaetomiumcochliodes)等能夠寄生于病原菌，引起寄主細胞大范圍裂解，從而對灰霉病有防治作用[26, 27]。

經過長期研究論證，利用木霉實現對病害的控制，其機理可分為抗生作用、溶菌作用、重寄生作用、誘導抗性作用和競爭作用[26, 28, 29]。木霉菌株在防治植物真菌性病害的方面具有顯著的應用潛力，不僅能夠有效控制植物諸多真菌病害的蔓延，而且實現了對生態系統穩定性方面的保持，同時也能夠有效提高農作物的品質，對農業的可持續發展戰略具有重要意義[9]。

木霉菌在防治枯萎病方面具有顯著效果，利用生防木霉菌防治植物真菌性病害正在受到行業專家的廣泛關注。高葦[30]在食用菌栽培的土壤中發現了1株綠色木霉菌株TH4能夠增強黃瓜對植株由尖孢鐮刀菌的侵染導致的枯萎病病原菌的抑制作用，從而使得枯萎病的發生減少，并且該綠色木霉菌株在黃瓜生產中具有一定的系統抗性。紀明山等[31]研究發現了1株綠色木霉菌株TR-8對尖孢鐮刀菌具有重寄生作用，且發現其代謝物對尖孢鐮刀菌孢子的防治效果可達到75.06%。木霉菌株對病原真菌的作用機制多種多樣。因此，篩選出優質的能夠有效提高對病原真菌防治效果的木霉菌株，對于枯萎病的生物防治將會有非常重要的研究意義。

該研究篩選的木霉菌株M13033-1生長速度快，對灰霉菌菌絲有較強的重寄生能力，能在短時間內迅速覆蓋灰霉菌的菌落，在離體黃瓜葉片和果實上噴施，對黃瓜灰霉病抑病率可達60%～80%，可作為防治黃瓜灰霉病的候選生物防治菌株，但其應用效果還有待于通過盆栽及田間試驗來進一步驗證，并通過改進發酵條件及增加生物防治因子等措施來提高防治效果。