水楊酸和茉莉酸甲酯對安絡小皮傘菌生長及多糖產量的影響

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

安絡小皮傘菌(Marasmiusandrosaceus)是我國傳統的藥用真菌，野生種質主要著生于濕潤多雨的枯木落葉上[1,2]。現代醫學中培養其菌絲體，經抽提，制成止痛浸膏或膠囊，具有止痛消炎等功效，對三叉神經痛、坐骨神經痛、面神經麻痹、偏頭痛和風濕性關炎等療效較好；對中輕度麻風神經痛、腰肌勞損等也有緩解作用[3～6]。而安絡小皮傘多糖是安絡小皮傘菌的重要活性物質之一[5,6]，更是具有抗高血壓、免疫調節、清除自由基、抗脂質過氧化、鎮痛、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗慢性肝炎等多種功效[5～9]，因此，怎樣增加其多糖的提取量十分關鍵。目前，主要采用誘變技術、優化培養基和優化提取工藝提高安絡小皮傘多糖的提取量[10～12]。

茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate, MeJa)是一種植物生長調節物質，在植物中廣泛存在，作為植物抗病信號傳遞體之一，影響了局部或系統的抗性[13]；作為與損傷相關的植物激素和信號分子，外源應用能夠激發防御植物基因的表達，誘導植物的化學防御，產生與機械損傷和昆蟲取食相似的效果[14]。水楊酸(Salicylic Acid, SA)是一種植物體內產生的具有生理調節作用的酚類化合物，作為重要的信號分子，可以誘導逆境相關蛋白的表達、激活植物超敏反應和系統獲得抗病、抗旱、抗冷的特性以及調節細胞抗氧化機制等[13～15]，從而提高植物對逆境脅迫的耐受能力。

植物激素不僅對植物生長具有重大的調節作用，而且針對靈芝等大型真菌生理反應也存在一定的調控作用[16]。為此，筆者在安絡小皮傘液態發酵過程中添加水楊酸或茉莉酸甲酯后，考察了這2種激素對安絡小皮傘菌(Marasmiellusandrosaceus)的生物量及多糖含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

安絡小皮傘菌由湖北欣愷生物有限公司提供，長江大學生命科學學院微生物實驗室保藏。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar, PDA)固態培養基：馬鈴薯200g，15～20g瓊脂，葡萄糖20g，水1000mL，自然pH。

馬鈴薯葡萄糖液態培養基(PDB)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。

1.1.3 主要藥品與試劑

包括葡萄糖、瓊脂、3,5 -二硝基水楊酸、茉莉酸甲酯、乙醇、苯酚(重蒸)、濃硫酸等，均為分析純級。

1.1.4 主要儀器與設備

SPX-250B-Z生化培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；BS-IE振蕩培養箱(國華電器有限公司)；HFsafe-1200超凈工作臺(上海力申科學儀器有限公司)；HVE-50立體式高壓滅菌鍋(上海三申醫療器械有限公司)；HH-4恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；UV-1800紫外分光光度計(日本島津公司)；DL-5-C高速冷凍離心機(上海市離心機械研究所)；ET-2010KA立式雙門回旋搖床(金壇市億通電子有限公司)；YE4A349120移液槍(北京金花儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養

將保藏的安絡小皮傘菌種接入含100mL的PDA培養基的250mL三角瓶中，25℃恒溫培養7d，存冰箱中備用。

1.2.2 孢子懸液的制備

20mL無菌蒸餾水加入到250mL三角瓶斜面培養基上，用接種環將培養基斜面上的孢子輕輕刮下，倒入帶有4層擦鏡紙的滅菌漏斗中過濾，然后將過濾的安絡小皮傘菌液倒入盛有滅菌小玻璃珠的50mL三角瓶中，25℃、150r/min震蕩15min，將孢子充分打散，得到均勻的單孢子懸液。

1.2.3 水楊酸和茉莉酸甲酯對安絡小皮傘菌產多糖的影響

將先配制好的0.1mol/L的水楊酸/茉莉酸甲酯溶液，向培養基中分別按梯度加入水楊酸 (0、10、50、100、250、500、750、1000μmol/L) 或者茉莉酸甲酯(0、10、30、50、70、90、110μmol/L)(此濃度為培養基中的終濃度)。經此初選后，再復篩水楊酸 (650、700、750、800、850μmol/L) 或者茉莉酸甲酯(80、85、90、95、100μmol/L)的濃度，確定促進安絡小皮傘菌胞內多糖(Intracellular polysaccharide,IPS)和胞外多糖(Extracellular polysaccharide, EPS)產量最大的濃度。每個梯度做3個平行試驗組。

1.2.4 水楊酸和茉莉酸甲酯對菌株生長的影響

將得到的菌懸液吸取2mL菌懸液加入到滅菌過的裝有100mL PDB液體培養基的250mL三角瓶。將加入800μmol/L水楊酸和90μmol/L茉莉酸甲酯的菌懸液分別作為處理組與對照組一起放入恒溫搖床中，25℃、150/min培養14d。每隔2d測1次生物量，記錄安絡小皮傘菌株的生物量的變化。

1.2.5 多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚硫酸法[5]。

1)葡萄糖標準曲線繪制 葡萄糖標準曲線繪制方法參照文獻[5]，得出溶液在490nm處的光密度(x)與標準葡萄糖溶液濃度(y,mg/mol)的回歸方程:y=4.1964x+0.06746，決定系數R2=0.99937。

2)樣品中多糖含量的測定 樣品中IPS濃度的測定：分別收集發酵后的菌絲體，蒸餾水清洗后進行干燥至恒重，稱取并記錄菌體的生物量，取0.03g充分水浸醇沉后溶于5mL蒸餾水，取1mL稀釋至5mL，后取2mL參照葡萄糖標準曲線繪制的方法在490nm 處測定溶液的光密度，并代入回歸方程算出浸提液濃度，計算IPS的產量(mg/g)。

樣品中EPS含量的測定：收集發酵液(100mL)，取1mL發酵液醇沉，沉淀溶解于5mL蒸餾水中，再取1mL稀釋至5mL，后取2mL參照葡萄糖標準曲線繪制的方法在490nm處測定溶液的光密度，并代入回歸方程算出浸提液濃度，計算EPS的產量(mg/100mL)。

1.2.6 安絡小皮傘菌生物量的測定

安絡小皮傘菌生物量采取菌體干重法測定[8]。將安絡小皮傘菌發酵液全部轉入離心管中，10000r/min的條件下離心4min，過濾得到安絡小皮傘的菌體組織。稱重記錄其濕重再放入60℃的烘箱中烘干。每隔5h測1次凈重，直到重量不發生變化為止，此時的重量即為菌體的凈重。

2 結果與分析

2.1 水楊酸對安絡小皮傘菌產多糖的影響

不同濃度水楊酸下安絡小皮傘菌的多糖產量如圖1所示。由圖1(a)可知，當水楊酸濃度高于10μmol/L后，隨著水楊酸濃度的增加，IPS和EPS產量也在增加；在750μmol/L濃度時，兩者的產量到達一個峰值，分別為151.12mg/g和485.58mg/100mL。再以750μmol/L為中心，進行小范圍復篩水楊酸促進安絡小皮傘菌多糖產量的最適濃度，其結果如1(b)所示。由圖1(b)可知，在水楊酸濃度為800μmol/L時，2種多糖產量均達到峰值，即此濃度為水楊酸對安絡小皮傘菌細胞產IPS的最佳促進濃度，此時IPS產量為158.36mg/g，較對照組增長了52.82%； EPS產量為497.65mg/100mL，較對照組增長了60.53%。

圖1 不同水楊酸濃度下的胞內外多糖產量

2.2 茉莉酸甲酯對安絡小皮傘菌產多糖的影響

不同濃度茉莉酸甲酯下安絡小皮傘菌的多糖產量如圖2所示。由圖2(a)可知，當茉莉酸甲酯濃度在10～90μmol/L時， 隨著茉莉酸甲酯濃度的增加，IPS和EPS產量也隨之增加。在濃度為90μmol/L時，IPS和EPS的產量均達到最大。再以90μmol/L為中心，確定茉莉酸甲酯促進安絡小皮傘多糖產量的最適濃度，其結果圖2(b)所示。由圖2(b)可知，在茉莉酸甲酯濃度為90μmol/L時，多糖產量先增后降，在90μmol/L時達到峰值，IPS和EPS產量均達到最大。即此濃度為茉莉酸甲酯對安絡小皮傘產IPS和EPS的最佳促進濃度。此時IPS產量為159.88mg/g，較對照組增長了48.24%； EPS產量為465.25mg/100mL，較對照組增長了44.19%。

圖2 不同濃度茉莉酸甲酯下胞內外多糖產量

2.3 水楊酸和茉莉酸甲酯對安絡小皮傘菌生長的影響

圖3 水楊酸和茉莉酸甲酯處理下不同發酵時間 的安絡小皮傘菌生物量

將加入800μmol/L水楊酸和90μmol/L茉莉酸甲酯的菌懸液分別作為處理組與對照組一起在恒溫搖床中培養14d，每隔2d測1次生物量，結果如圖3所示。由圖3可知，在安絡小皮傘的緩慢生長期(1～4d)內，2個處理組與對照組相比，動力學趨勢基本一致。緩慢生長期基本上不發生變化。快速生長期(4～12d)時，菌體的動力學曲線斜率明顯增大，單位時間內菌體指標變化加快，物質積累增長率變大。其中水楊酸對安絡小皮傘的生長量影響明顯，從第4天起，2個處理組的菌體開始快速增長，第8天后，水楊酸處理組的生長量明顯高于對照組。第12天達到峰值。可見水楊酸提高多糖的產量與其促進菌種生長有關。整個培養期，茉莉酸甲酯對菌體的生長量沒有明顯影響，其處理組與對照組沒有差異。說明茉莉酸甲酯促進多糖產量不是通過促進安絡小皮傘的生長，而是以調節相關的代謝過程促進多糖的生成。

3 結論

研究結果表明，水楊酸和茉莉酸甲酯都可使安絡小皮傘菌胞內外的多糖產量明顯提高；水楊酸可促進安絡小皮傘菌生物量增加，茉莉酸甲酯對安絡小皮傘菌生物量沒有影響，該結果為水楊酸和茉莉酸甲酯應用于液態發酵提高真菌多糖產量提供了科學依據。