響應(yīng)面優(yōu)化胡麻粕蛋白提取工藝及其功能性質(zhì)研究

伊莉，吳鎖柱，孟瓊宇，張毓，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

胡麻，又稱亞麻，是亞麻科、亞麻屬一年生或者多年生的草本植物，在我國許多地區(qū)都有種植，如甘肅、新疆、內(nèi)蒙，寧夏、河北和山西等地區(qū)[1]。胡麻籽是胡麻的種子，常用于榨取油脂。胡麻粕則是胡麻籽經(jīng)過榨油后產(chǎn)生的殘渣，一般直接廢棄或者作為飼料喂養(yǎng)畜禽，并沒有得到有效的利用。

胡麻粕中含有多種成分，其中最主要的成分為胡麻粕蛋白，除此之外還含有一定量的胡麻膠、礦物質(zhì)、維生素等成分[2-3]。胡麻粕蛋白質(zhì)含量約為30%～50%[4]，屬于麻仁球蛋白，胡麻粕蛋白中氨基酸種類十分豐富，約有18 種，與大豆蛋白相比，胡麻粕蛋白中的精氨酸和谷氨酸等氨基酸含量更高。研究表明，胡麻粕蛋白不僅能增強(qiáng)人體的免疫功能，而且能用于輔助治療患有燒傷、癌癥、肝炎、外傷等營養(yǎng)不良的病人，有很好的研究和應(yīng)用價值[5]。

目前，植物原料中蛋白質(zhì)的提取方法主要有堿溶酸沉法，超聲輔助法，酶解法等[6-13]。為了進(jìn)一步提高胡麻粕中蛋白質(zhì)的提取率，本文以胡麻粕為原料，采用堿溶酸沉的方法提取蛋白，再通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并對提取得到的蛋白進(jìn)行功能性質(zhì)的初步研究，以期對胡麻粕的回收利用和提高胡麻榨油副產(chǎn)品的附加值提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

胡麻粕：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所；石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、雙氧水均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：上海邁坤化工有限公司；牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

78HW-1 型磁力攪拌器：金壇市城東新瑞儀器廠；LXJ-64-01 型離心機(jī)：北京醫(yī)療儀器廠；DZKW-4 型恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；S10 型勻漿機(jī)：上海市百典儀器有限公司；Q300-B6 型粉碎機(jī)：永康市哈瑞工貿(mào)有限公司；DER-43 型凱氏定氮儀：上海超越實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；STARTER 3100 型pH 計：HAUS 儀器有限公司；WFJ 2100 型紫外分光光度計：尤尼克儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

胡麻粕篩選揀除雜質(zhì)后粉碎，過80 目篩，以料液比為1∶3（g/mL）加入石油醚進(jìn)行脫脂處理，在室溫（25 ℃）下用磁力攪拌器攪拌2 h，再靜置6 h，棄去上清液。脫脂后的胡麻粕粉石油醚充分揮發(fā)后收集備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

精確稱取脫脂后的胡麻粕粉5.0 g，按照不同的料液比加入蒸餾水，攪拌使混合均勻。以1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至一定數(shù)值，置于不同溫度的恒溫水浴中提取一定時間，取出后冷卻至室溫（25 ℃），4 000 r/min條件下離心20 min，棄去沉淀，上清液以1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 值至等電點(diǎn)4.4，靜置15 min 沉淀蛋白質(zhì)，4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，除去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌2 次以脫去無機(jī)鹽等雜質(zhì)，得到純度較高的胡麻粕蛋白，計算提取率。各水平的選擇詳見表1。

表1 單因素試驗(yàn)水平選擇Table 1 Factors and levels used in single-factor tests

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用由Box 提出的中心組合設(shè)計原理結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化法，對胡麻粕蛋白提取過程中的料液比、浸提溫度、浸提時間、浸提液pH 值4個工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 胡麻粕蛋白提取率測定方法

1.3.4.1 胡麻粕中總蛋白質(zhì)含量的測定

采用微量凱氏定氮法[14]測定粗蛋白中總蛋白質(zhì)含量。

1.3.4.2 提取粗蛋白中蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[14]測定胡麻粕中總蛋白質(zhì)含量。以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 胡麻粕蛋白提取率計算

計算方法見式（1）。

式中：N 為提取得到的粗蛋白中蛋白質(zhì)含量，g；M為胡麻粕樣品中蛋白質(zhì)含量，g。

1.3.5 胡麻粕蛋白等電點(diǎn)的測定

蛋白質(zhì)在溶液中有兩性電離的現(xiàn)象。當(dāng)某一溶液中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）=pH 值時，該溶液解離的正負(fù)離子數(shù)相等，凈電荷為0，蛋白質(zhì)的溶解度最小，這一時刻蛋白質(zhì)將會最大程度地呈現(xiàn)絮狀析出，此時就是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)[14]。本文測得的胡麻粕蛋白的等電點(diǎn)為4.4。

1.3.6 胡麻粕蛋白功能性質(zhì)測定

1.3.6.1 持水性測定

稱取由最優(yōu)條件制得的蛋白質(zhì)0.5 g 與5 mL 蒸餾水置于離心管中，用玻璃棒攪拌均勻，室溫（25 ℃）下靜置30 min，離心，棄去上清液后稱重。按式（2）計算持水性[15]。

1.3.6.2 溶解性的測定

取3 mL 10 mg/mL 胡麻粕蛋白溶液，于4 000 r/min的條件下離心5 min，將離心后所得上清液倒入試管內(nèi)，用考馬斯亮藍(lán)比色法測定其含量。按式（3）計算溶解度[16-17]。

1.3.6.3 乳化性測定

取15 mL 20 mg/mL 的胡麻粕蛋白溶液，用中速勻漿機(jī)勻漿30 s 后加入15 mL 花生油并不斷混勻，再勻漿1 min 后移入刻度離心管中，在2 700 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，取出讀取體積。按式（4）計算乳化性[18-19]。

1.3.6.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定

準(zhǔn)確稱取1.0 g 胡麻粕蛋白，加水配成10 mg/mL 的樣品溶液，用轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 的勻漿機(jī)攪拌1 min后，迅速轉(zhuǎn)入量筒中，測量體積并按式（5）計算起泡能力；泡沫靜止20 min 后，再記錄體積并按式（6）計算泡沫穩(wěn)定性[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

本試驗(yàn)采用牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of BSA

得到回歸方程為y=0.563 3x+0.013 1，R2=0.998 5。式中：x 為牛血清蛋白濃度，mg/mL，y 為吸光度值。線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 浸提溫度對胡麻粕蛋白提取率的影響

浸提溫度對胡麻粕蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 浸提溫度對提取效果的影響Fig.2 The effect of temperature on the extraction ratio of protein

從圖2 中可觀察到，在30 ℃～60 ℃的范圍內(nèi)，隨著浸提溫度的升高，胡麻粕蛋白提取率呈現(xiàn)出先升高后緩慢下降的趨勢，其中，當(dāng)溫度為40 ℃時提取率達(dá)到最高值；當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時，胡麻粕蛋白提取率出現(xiàn)明顯下降，可能的原因是高溫使蛋白質(zhì)變性，影響提取。綜合考慮節(jié)約能源等因素，胡麻粕蛋白的較適宜浸提溫度為40 ℃。

2.2.2 浸提時間對胡麻粕蛋白提取率的影響

浸提時間對胡麻粕蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 浸提時間對提取效果的影響Fig.3 The effect of time on the extraction ratio of protein

從圖3 中可觀察到，時間對胡麻粕蛋白的提取率影響不大，隨著時間的延長，胡麻粕蛋白的提取率略微上升，最后趨于平緩。說明隨著加熱時間的延長，胡麻粕蛋白的析出率變大，但時間過長后，除了使提取時間無效延長之外，還易引起蛋白質(zhì)變性，而使胡麻粕蛋白提取率下降。綜合考慮，胡麻粕蛋白的較適宜浸提時間為60 min。

2.2.3 料液比對胡麻粕蛋白提取率的影響

料液比對胡麻粕蛋白提取率的影響如圖4 所示。

從圖4 中可觀察到，料液比對胡麻粕蛋白的提取效果影響顯著，在料液比從 1∶20（g/mL）到 1∶30（g/mL）的過程中，胡麻粕蛋白提取率呈較明顯的上升趨勢；料液比從 1∶30（g/mL）到 1∶35（g/mL）時，提取率仍緩慢上升；而后繼續(xù)增大溶液體積，胡麻粕蛋白提取率呈現(xiàn)下降趨勢，可能的原因是過大的溶液體積使蛋白質(zhì)沉淀較困難，使產(chǎn)品得率下降。綜合考慮，胡麻粕蛋白提取較適宜的料液比為1∶35（g/mL）。

圖4 料液比對提取效果的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction ratio of protein

2.2.4 pH 值對胡麻粕蛋白提取率的影響

料液比對胡麻粕蛋白提取率的影響如圖5 所示。

圖5 pH 值對提取效果的影響Fig.5 The effect of pH value on the extraction ratio of protein

從圖5 中可觀察到，pH 值對胡麻粕蛋白的提取率有較顯著的影響，在pH 值為8～11 的范圍內(nèi)，隨著pH 值升高，胡麻粕蛋白的提取率也隨之升高，當(dāng)pH值大于11 時，因堿性太強(qiáng)就會產(chǎn)生一系列反應(yīng)，如脫氨，脫羧，肽鍵斷裂等引起胱賴反應(yīng)，使氨基酸變?yōu)橛卸疚镔|(zhì)。且顏色會變深，產(chǎn)生異味，這些因素都不利于對胡麻粕蛋白的提取。綜合考慮，胡麻粕蛋白提取較適宜的pH 值為11。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

通過對單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，可知在考察的4個因素中，對胡麻粕蛋白提取率影響較顯著的因素為浸提溫度、料液比和pH 值。因此，用Design-Expert8.0.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及回歸分析，采用Box-Behnken 方法，以胡麻粕蛋白提取率作為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，考察浸提溫度、料液比和pH 值對胡麻粕蛋白提取效果的影響。試驗(yàn)設(shè)計方案和試驗(yàn)結(jié)果見表2 和表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計試驗(yàn)自變量因素編碼及水平表Table 2 The coding and horizontal table of the response surface design experiment

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

以浸提溫度、料液比和pH 值為關(guān)鍵工藝參數(shù)，通過響應(yīng)面分析法得出回歸方程為：胡麻粕蛋白提取率Y=39.94+2.19A-0.044B-0.76C-0.42AB+0.072AC-0.11BC-7.09A2-0.77B2-3.12C2。

為驗(yàn)證模型的有效性，對其進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4 所示。

由表4 可知，回歸模型P＜0.000 1，表明模型擬合較好，可靠性強(qiáng)。對胡麻粕蛋白提取率影響極顯著的是A 及二次項(xiàng)A2和C2，影響顯著的是C；失擬項(xiàng)P=0.515 8，不顯著，表明模型與實(shí)際情況擬合較好，可用于預(yù)測胡麻粕蛋白提取的最佳工藝條件。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，由胡麻粕蛋白提取率的二次回歸方程可知，各因素影響結(jié)果的主次順序?yàn)锳＞C＞B，即料液比＞pH 值＞浸提溫度。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.3.2 胡麻粕蛋白提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析

為了進(jìn)一步研究浸提溫度、料液比和pH 值及各因素之間的相互作用對胡麻粕蛋白提取率的影響，運(yùn)用Design-Expert.8.0.6 軟件作出響應(yīng)曲面如圖6 所示。

圖6 料液比、浸提溫度和浸提液pH 值兩兩交互的響應(yīng)面曲線Fig.6 Response surface plots of interactive iffect on the concentration of solid-liquid radio，extraction temperature and pH value

從圖6 可以直觀看出各因素之間的交互作用對胡麻粕蛋白提取率的影響。圖6（a）和（b）響應(yīng)曲面的坡度較大，說明料液比與浸提pH 值，料液比與浸提溫度的交互作用明顯，且響應(yīng)面中有明顯的峰值，其中料液比的影響最大。在料液比一定時，隨著pH 值的升高，胡麻粕蛋白的提取率先增大，pH 值到達(dá)11 后，胡麻粕蛋白的提取率下降。當(dāng)pH 值一定時，溶液體積增大，胡麻粕蛋白的提取率先增大后減小。當(dāng)浸提溫度保持一定值時，隨著溶液體積的增大，胡麻粕蛋白的提取率先明顯上升，到達(dá)峰值后又下降。當(dāng)料液比保持一定值時，隨溫度的增大，胡麻粕蛋白的提取率先趨于平緩，到達(dá)60 ℃時，明顯下降。圖6（c）可以看出浸提溫度與浸提的pH 值交互作用不顯著，且溫度對胡麻粕蛋白的提取率的影響最小，相同的pH 值下，浸提溫度改變胡麻粕蛋白的提取率幅度較小。

運(yùn)用回歸方程對胡麻粕蛋白提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，預(yù)測最佳提取工藝條件為：料液比1∶35.77（g/mL），浸提溫度39.69 ℃，浸提液pH 值10.88。在此條件下，胡麻粕蛋白提取率的理論值為41.56%。根據(jù)實(shí)際情況，對工藝條件進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后的最佳提取條件為：料液比1∶36（g/mL），浸提溫度39.7 ℃，浸提液pH 10.9。在此條件下重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)3 次，得到胡麻粕蛋白實(shí)際提取率平均值為41.48%，與理論值基本一致。

2.4 胡麻粕蛋白功能性質(zhì)的測定結(jié)果及分析

試驗(yàn)初步研究了胡麻粕蛋白的功能性質(zhì)，并與大豆分離蛋白作出比較，結(jié)果見表5。

表5 胡麻粕蛋白功能性質(zhì)檢測結(jié)果Table 5 The results of property function of flaxseed flake protein%

由表5 可知，胡麻粕分離蛋白比大豆蛋白的持水能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)與水的結(jié)合主要取決于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、表面疏水性等因素，胡麻在榨油過程中可能引起了部分蛋白質(zhì)變性，使親水基團(tuán)暴露出來，也可能是胡麻粕蛋白中含有少量多糖，增加了親水基團(tuán)，使之更容易與水結(jié)合。蛋白質(zhì)的溶解性是非常重要的功能特性，溶解度數(shù)據(jù)可以用來確定天然蛋白質(zhì)的提取，分離和純化過程，對于蛋白質(zhì)變性程度也可作為重要指標(biāo)，蛋白質(zhì)在飲料中的應(yīng)用也與其溶解性有很大關(guān)系。

胡麻粕蛋白的表面性質(zhì)（包括乳化性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性）也略優(yōu)于大豆蛋白，主要是由于胡麻粕蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其親油性，親脂性基團(tuán)暴露出來，增強(qiáng)其乳化性能。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以胡麻粕為原料，通過單因素試驗(yàn)研究了料液比、浸提溫度、pH 值和浸提時間對胡麻粕蛋白提取率的影響；在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取了對胡麻粕蛋白提取影響較大的料液比、浸提溫度和pH 值3個因素設(shè)計了響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到胡麻粕蛋白提取的最優(yōu)工藝條件為：料液比1∶36（g/mL），浸提溫度39.7 ℃，浸提液pH 10.9。在此條件下胡麻粕蛋白提取率達(dá)到41.48%。對最優(yōu)工藝條件下提取得到的胡麻粕蛋白進(jìn)行初步功能性質(zhì)分析可知，與大豆蛋白相比，胡麻粕蛋白具有更好的溶解性，持水性，乳化性，起泡性和泡沫穩(wěn)定性，這為胡麻粕蛋白廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中奠定了良好的基礎(chǔ)。

胡麻籽用于壓榨油脂，受到消費(fèi)者的歡迎，而胡麻粕則一般只能用于畜禽飼料，造成浪費(fèi)，如果能探索出提取蛋白的最佳工藝條件，將胡麻粕進(jìn)行回收利用，將會產(chǎn)生廣泛的經(jīng)濟(jì)效益。