一種復(fù)合抗氧化果蔬酵素的開發(fā)及活性研究

楊志鵬，王建彬，文婷婷，韓墨，趙鑫君，張晶晶，王婷，*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250353；2.諸城東曉生物科技有限公司，山東諸城262200；3.山東省種子管理總站，山東濟(jì)南250353）

自由基是維持正常生命所必需的物質(zhì)，同時(shí)也是大分子、細(xì)胞的“危險(xiǎn)殺手”。自Harman 首次提出衰老的自由基氧化應(yīng)激學(xué)說以來，經(jīng)過60 多年的發(fā)展，自由基氧化應(yīng)激學(xué)說越來越被人群所接受，許多老齡化疾病的發(fā)病機(jī)制都與機(jī)體參與氧化應(yīng)激有關(guān)[1]。究其原因，很大一方面是由于機(jī)體長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生過多或清除自由基的酶類產(chǎn)生減少，氧自由基的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞，機(jī)體內(nèi)部自由基清除能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，從而引起疾病和衰老[2-3]。果蔬中富含多種天然的抗氧化活性物質(zhì)，如多酚類的白藜蘆醇、黃酮類的蘆丁、維生素C（抗壞血酸）、維生素B2（核黃素）、類胡蘿卜素等，以及近期研究發(fā)現(xiàn)的番茄紅素（lycopene）、類黃酮（flavonoids）及花青素（anthocyanin），以上物質(zhì)均具有清除含氧自由基，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)平衡，提高免疫力，延緩衰老的功能[4]。

酵素是指以動(dòng)物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品，其包含了天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酶、有益微生物及其活性代謝物[5]。酵素產(chǎn)品日趨火熱，也體現(xiàn)了大眾認(rèn)識(shí)到合理飲食對(duì)健康的重要性，但是目前對(duì)于功能性明確的酵素產(chǎn)品研究較少。精選天然抗氧化能力強(qiáng)的果蔬為原料，經(jīng)益生菌分解和代謝，釋放出其所含原花青素、多酚、維生素等天然功效成分，可直接參與人體新陳代謝，通過阻斷自由基鏈反應(yīng)，減少自由基的產(chǎn)生或清除自由基等形式提高機(jī)體的抗氧化能力，并具有潛在的抗炎、免疫調(diào)節(jié)和延緩機(jī)體衰老的功效[6-8]。因此，通過開發(fā)具有抗氧化功能的復(fù)合果蔬酵素并對(duì)其中天然活性成分進(jìn)行研究，對(duì)開發(fā)具有潛在調(diào)節(jié)人體腸道菌群，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除體內(nèi)自由基，延緩衰老、提高機(jī)體免疫力的功能食品具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠李糖乳桿菌 217-1、217-3、217-8 為齊魯工業(yè)大學(xué)生物制藥工程研究所保藏菌株[9]。

1.2 設(shè)備

RS232-C 分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；UV-5500PC 離心機(jī)：湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；DJ1-012 打漿機(jī)：靖江舜天工業(yè)設(shè)備制造有限公司；LDZX-50KB 滅菌鍋：上海復(fù)昌科技有限公司；SHP-150恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FE20 酸度計(jì)：武漢永勝科技有限公司；LC-VP 高效液相色譜：日本島津公司。

1.3 試劑和材料

乳酸菌培養(yǎng)基（Lactobacilli MRS broth）：海博生物有限公司；氯化鈉、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、葡萄糖、茚三酮、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、沒食子酸、碳酸鈉、福林酚試劑、鹽酸、硫酸鐵銨、正丁醇、異丙醇、甲酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；DPPH：Sigma 公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津富宇精細(xì)化工有限公司；核黃素（維生素B2）標(biāo)準(zhǔn)品、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 抗氧化復(fù)合果蔬酵素的制備

選取檸檬、蘋果、桑葚、菠蘿、草莓、番茄等多種果蔬，清洗潔凈后打漿。加入果膠酶酶解并調(diào)節(jié)pH 值為5～7，后 105 ℃滅菌 20 min。待溫度降為 25 ℃～35 ℃時(shí)加入鼠李糖乳桿菌217-1、217-3 和217-8 進(jìn)行37 ℃恒溫發(fā)酵。酵素于超凈工作臺(tái)混勻后取樣，后4 000 r/min 離心10 min，取上清液，待測(cè)。對(duì)照原溶液為果蔬打漿、酶解并調(diào)節(jié)pH 值后，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，待測(cè)。

1.4.2 抗氧化果蔬酵素活菌數(shù)與pH 值的檢測(cè)

采用平板計(jì)數(shù)法和pH 計(jì)分別檢測(cè)酵素發(fā)酵階段乳酸菌和pH 值的變化[5]。

接入乳酸菌后，從0 h 開始，每隔5 h 對(duì)酵素取樣一次，持續(xù)10 次。于超凈工作臺(tái)中對(duì)一定量樣品進(jìn)行梯度稀釋，后取適宜濃度梯度的酵素稀釋液涂布于MRS 平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。取樣品用pH 計(jì)檢測(cè)酵素中的pH 值。

1.4.3 抗氧化果蔬酵素總糖含量的檢測(cè)

采用苯酚-硫酸法檢測(cè)酵素中的總糖含量[10]。

準(zhǔn)確分別吸取100 mg/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于試管中并用蒸餾水補(bǔ)至 1.0 mL。向試管中加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL 硫酸，靜置10 min。渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，將試管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，490 nm 測(cè)吸光度。取1.0 mL的待測(cè)樣品重復(fù)上述操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算樣品的總糖含量。

1.4.4 抗氧化果蔬酵素多酚含量的檢測(cè)

采用福林酚試劑法檢測(cè)酵素中多酚含量[11]。

取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 10、20、30、40、50 μg/mL的沒食子酸工作液。分別取沒食子酸工作液和蒸餾水各1 mL 于試管中，加入5.0 mL 10%福林酚試劑，反應(yīng)5 min 后加入7.5%的Na2CO3溶液4 mL，搖勻后25 ℃放置60 min，于765 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。取1.0 mL的待測(cè)樣品重復(fù)上述操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算樣品中多酚含量。

1.4.5 抗氧化果蔬酵素黃酮含量的檢測(cè)

分別吸取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL 容量瓶中，加入0.15 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液，混勻放置6 min。加10%的Al（NO3）3溶液0.15mL，搖勻放置6min。最后加入2 mL 4%的NaOH 溶液，以甲醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[12]。取1.0 mL 的待測(cè)樣品用甲醇定容于10 mL 容量瓶中，后取1 mL 提取液重復(fù)上述操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.4.6 抗氧化果蔬酵素核黃素的檢測(cè)

采用高效液相色譜法檢測(cè)酵素中核黃素的含量[13]。

取核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合、稀釋、定容配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以此標(biāo)準(zhǔn)溶液為最高濃度稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。同時(shí)吸取酵素樣品進(jìn)行液相色譜分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酵素中核黃素的含量。

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A：25 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖液，B：乙腈；梯度洗脫條件：起始 5 min 內(nèi) 100%A 洗脫，隨后20 min 內(nèi)A 相體積比由100%線性下降至75 %，保持5 min 后，恢復(fù)至100 % A 平衡色譜柱10 min；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣器溫度：4 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；采集波長(zhǎng)設(shè)定為 267 nm。

1.4.7 抗氧化果蔬酵素原花青素的研究

采用GB/T 22244-2008《保健食品中前花青素的測(cè)定》測(cè)定酵素中原花青素的含量。

液相條件為色譜柱：C18 柱；柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：525 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相（體積比）：水+甲醇+異丙醇+甲酸=73+13+6+8；流速：1.0 mL/min。

根據(jù)含量準(zhǔn)確吸取1 mL～5 mL 樣液，置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。將正丁醇與濃鹽酸按95∶5 的體積比混合后，取出15 mL 置于具塞錐瓶中，再加入0.5 mL 硫酸鐵銨溶液和2 mL 試樣溶液，混勻，置沸水浴精確加熱40 min 后，立即置冰水中冷卻，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.4.8 抗氧化果蔬酵素抗氧化性的研究

采用DPPH 自由基清除試驗(yàn)?zāi)M機(jī)體內(nèi)清除自由基。

取100 μL 各稀釋梯度的樣品溶液加至試管中，然后向每管加入3.9 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，混勻，37 ℃避光水浴1 h 后于517 nm 下測(cè)定吸光度。以乙醇做空白對(duì)照，蒸餾水調(diào)零，每個(gè)樣品均平行測(cè)定3 次，結(jié)果以IC50值表示。IC50是指DPPH 自由基清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度[14]。DPPH 自由基清除率按下式計(jì)算：

式中：Ac 為空白對(duì)照管的吸光度；As 為樣品測(cè)定管的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵時(shí)間的確定

復(fù)合抗氧化果蔬酵素中pH 值和活菌數(shù)變化曲線見圖1。

圖1 復(fù)合抗氧化果蔬酵素中pH 值和活菌數(shù)變化曲線Fig.1 Change curve of pH value and number of living bacteria in Jiaosu

由圖1 所示，在復(fù)合抗氧化果蔬酵素發(fā)酵過程中，0～5 h 乳酸菌處于延滯期，pH 值下降緩慢。5 h～25 h，乳酸菌處于對(duì)數(shù)期，鼠李糖乳桿菌快速增值，消耗C、N 源并產(chǎn)生大量的乳酸，pH 值由6.12 迅速下降至3.52。隨著乳酸的積累和營(yíng)養(yǎng)消耗，25 h～45 h 鼠李糖乳桿菌進(jìn)入穩(wěn)定期生長(zhǎng)平穩(wěn)，乳酸生成減少，pH 值緩慢下降并穩(wěn)定在3.20 左右，因此將發(fā)酵時(shí)間確定為40 h～50 h。復(fù)合抗氧化果蔬酵素選用的鼠李糖乳桿菌217-1、217-3、217-8 分離于健康兒童的腸道菌群，經(jīng)體外益生評(píng)價(jià)試驗(yàn)，具有顯著的酸、膽鹽、人工胃腸液耐受能力，同時(shí)高產(chǎn) γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和具備高效降膽固醇能力[9]。因此，以鼠李糖乳桿菌作為出發(fā)菌株發(fā)酵復(fù)合抗氧化果蔬，能夠有效的將果蔬中的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為利于人體吸收利用的小分子成分，同時(shí)產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡、促進(jìn)細(xì)胞分裂能力，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除體內(nèi)自由基，提高機(jī)體免疫力，起到排毒養(yǎng)顏、延緩衰老的作用[15]。

2.2 抗氧化復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵階段總糖含量的變化趨勢(shì)

復(fù)合抗氧化果蔬酵素總糖含量的變化趨勢(shì)見圖2。

圖2 抗氧化果蔬酵素總糖含量變化曲線Fig.2 Change curve of total sugar content of Jiaosu

如圖2 所示，復(fù)合抗氧化果蔬酵素的初始總糖含量是120.5 mg/mL。發(fā)酵30 h 的時(shí)候，總糖為35.29 mg/mL。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到50 h 左右的時(shí)候，總糖濃度下降到了24.37 mg/mL。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：發(fā)酵初期糖代謝較為旺盛，鼠李糖乳桿菌快速增值，是產(chǎn)生乳酸的關(guān)鍵時(shí)期。在發(fā)酵后期隨菌株的生長(zhǎng)受到抑制，糖代謝減緩，糖的利用率下降。

2.3 抗氧化復(fù)合果蔬酵素多酚和黃酮含量的檢測(cè)對(duì)比

抗氧化果蔬酵素與原溶液中活性成分含量見圖3。

圖3 抗氧化果蔬酵素與原溶液中活性成分含量Fig.3 The content of active ingredients in Jiaosu and raw solution

酵素中多酚和黃酮含量如圖3 所示，復(fù)合抗氧化果蔬酵素中的多酚含量為1.02×103mg/L，原溶液的含量為7.89×102mg/L，發(fā)酵后酵素中的多酚含量提升了29.3%。原溶液的黃酮含量為1.49×102mg/L，復(fù)合抗氧化果蔬酵素中的黃酮含量為2.07×102mg/L，較比于原溶液，經(jīng)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后提高了38.9%。黃酮及多酚類化合物是植物中具有抗氧化、抗衰老等諸多生理活性的天然活性物質(zhì)，其可作為抗氧化劑，提高機(jī)體清除自由基，減少組織細(xì)胞的氧化損傷；調(diào)節(jié)DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成，免受衰老因子的損傷；作為信號(hào)因子，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，改善衰老機(jī)體代謝情況[6]。因此，酵素中多酚及黃酮類化合物含量的上升，具有清除體內(nèi)自由基、延緩衰老的潛能。

2.4 抗氧化復(fù)合果蔬酵素核黃素含量的檢測(cè)對(duì)比

抗氧化果蔬酵素核黃素液相色譜圖見圖4。

圖4 抗氧化果蔬酵素核黃素液相色譜圖Fig.4 Rboflavin liquid chromatogram of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

核黃素的液相色譜圖如圖4 所示，其保留時(shí)間為25.8 min。對(duì)照原溶液中核黃素含量為47.9 mg/L，復(fù)合抗氧化果蔬酵素中核黃素含量為51.4 mg/L，發(fā)酵后核黃素含量提高了7.3%。據(jù)研究表明，核黃素為體內(nèi)黃酶類輔基的組成部分，具有一定的抗氧化活性，當(dāng)缺乏時(shí)會(huì)影響機(jī)體的生物氧化，使代謝發(fā)生障礙，它的作用機(jī)理與黃素酶-谷胱甘肽還原酶有關(guān)[16]。

2.5 復(fù)合抗氧化果蔬酵素原花青素含量的檢測(cè)對(duì)比

原花青素的液相色譜圖見圖5。

圖5 抗氧化果蔬酵素原花青素液相色譜圖Fig.5 Procyanidin liquid chromatogram of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

由圖5 可知，其保留時(shí)間為6.8 min。復(fù)合抗氧化果蔬酵素中原花青素含量為1.98×102mg/L，原溶液中的含量為1.82×102mg/L，原花青素含量相比發(fā)酵前提高了8.8%。原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性，自由基的清除活性顯著高于維生素C 和維生素E，同時(shí)原花青素還具有預(yù)防心血管疾病、降“三高”和抗腫瘤的作用。通過鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵，使果蔬中的原花青素充分提取，有助于提高機(jī)體的免疫力，減緩人體的衰老[17]。

2.6 復(fù)合抗氧化果蔬酵素抗氧化能力的檢測(cè)對(duì)比

復(fù)合抗氧化果蔬酵素抗氧化能力的檢測(cè)對(duì)比見圖6、圖 7。

圖6 抗氧化果蔬酵素清除率曲線Fig.6 Clearance rate curve of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

圖7 原溶液清除率曲線Fig.7 Clearance rate curve of raw solution

通過DPPH 抗氧化性試驗(yàn)可得出，復(fù)合抗氧化果蔬酵素自由基清除率曲線如圖6 所示，IC50值為0.074；原溶液的自由基清除率曲線如圖7 所示，其IC50值為0.148。通過對(duì)比可得抗氧化果蔬酵素的自由基清除率提高了100%，抗氧化能力顯著提高[18]。

3 結(jié)論

抗氧化復(fù)合果蔬酵素以高生物活性成分的提取為研究目的，研究了酵素發(fā)酵階段菌活、pH 值和總糖的變化特點(diǎn)，得到其發(fā)酵時(shí)間為40 h～50 h，并通過與發(fā)酵前原溶液中的生物活性成分以及抗氧化能力的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，復(fù)合果蔬酵素發(fā)酵后的天然活性成分如多酚含量提高了29.3%，黃酮提高了38.9%，核黃素含量提高7.3%，原花青素提高8.8%，抗氧化能力提高了100%。該酵素經(jīng)益生菌轉(zhuǎn)化后，將原料中的天然抗氧化活性成分完整保留并釋放，并產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物，參與人體新陳代謝并提高機(jī)體的抗氧化能力和免疫水平，清除體內(nèi)過剩自由基，促進(jìn)細(xì)胞增殖，潛在的調(diào)節(jié)人體內(nèi)腸道平衡，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高機(jī)體免疫力，預(yù)防皮膚早衰、延緩衰老等方面具有重要潛能。