游離脂肪酸受體FFAR4/GPR120在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

郭文靜，伍春梅，居琦，李金平

中國已成為乳腺癌發病率全球增長最快的國家之一，乳腺癌發病率位居我國女性惡性腫瘤首位[1]。目前對于乳腺癌的發病機制在分子領域中的研究發展迅速，GPR120近期被研究證實為長鏈脂肪酸受體，屬于進化高度保守的視紫紅質家族孤兒受體，鏈長度不同的長鏈脂肪酸(LCFAs)能夠結合并活化GPR120，進而激活不同的信號通路而發揮不同的生物學功效[2]。作為ω-3脂肪酸的受體GPR120，大多數研究局限于肥胖和炎性反應等一些代謝性疾病的領域，其中炎性反應可作為多種惡性腫瘤發生的危險因素，因此，近年來已有不少關于GPR120與惡性腫瘤組織發生發展的相關研究[3]。目前GPR120與癌癥進展相互關系的研究結果不一，相關研究數據顯示其在不同腫瘤中發揮著不同的的生物學作用,尤其是在乳腺癌發生發展中的作用尚不明確。本研究采用了免疫組織化學染色法檢測GPR120在人乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達,結合臨床病理資料,進而分析其與臨床病理學特征的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集 2016年10月—2017年10月寧夏醫科大學總醫院腫瘤醫院腫瘤外一科行手術獲取的乳腺癌石蠟標本125份及癌旁正常組織標本63份，所有病例術前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療,排除合并其他惡性腫瘤和癌前病變者以及患有嚴重的心、肺等器質性病變或嚴重的肝腎功能損害者。所有納入患者均為女性，年齡27～80 (49.62±10.32)歲，<35周歲10例，35～55歲87例，>55歲28例；病理類型，浸潤性小葉癌20例，浸潤性導管癌96例，其他特殊類型乳腺癌9例；組織學分級，Ⅰ級14例，Ⅱ級49例，Ⅲ級41例；pTNM分期(根據AJCC乳腺癌TNM分期2017年版),Ⅰ期43例，Ⅱ期56例，Ⅲ期26例；伴腋窩淋巴結轉移57例，無腋窩淋巴結轉移68例。依據乳腺癌組織中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)及細胞增殖核抗原Ki-67的表達情況，可將其分為4種不同的乳腺癌分子亞型：Luminal A型(35例)、B型(48例)、HER-2過表達型(18例)與三陰型乳腺癌(TNBC型)(24例)；不同分子分型的乳腺癌，其疾病的進展、治療的方式、治療療效、復發及轉移都不盡相同[4]。

1.2 觀察指標與方法 本研究經脫蠟和水化、抗原修復、過氧化物封閉、一抗孵育(以PBS緩沖液代替一抗為空白對照，以已知陽性切片為陽性對照；一抗兔抗人GPR120抗體的工作濃度為1∶150，兔抗人GPR120抗體購自英國ABCAM公司)、二抗孵育(二抗為快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，購自北京中杉金橋生物技術有限公司)、DAB顯色(濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司)、干燥封片等免疫組化染色SP法步驟，其均在病理科實驗專業技術人員的指導下嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.1 GPR120蛋白表達檢測：CPR120 主要在細胞膜呈陽性表達，部分表達于細胞質，以黃色、棕黃色著色為主，最終運用雙盲法進行結果觀察，由2位病理醫師在顯微鏡下進行閱片，采用半定量評估法進行結果判讀[5]。

1.2.2 ER、PR、雄激素受體(AR)、HER-2和Ki-67等指標：直接從寧夏醫科大學總醫院病例信息系統中獲取。

1.3 結果判斷 采取半定量評估方法對GPR120在組織中的陽性表達情況進行結果判讀:(1)依據染色強度評分，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分, 黃褐色為3分；(2)依據陽性染色細胞百分率計分，<10%記作0分， 10%～25%記作1分， >25%～50%記作2分，>50%～75%記作3分，>75%記作4分；最后將(1)×(2)的結果作為陽性指數(0～12分)進行判定，<4分為陰性，≥4分為陽性。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織及癌旁正常組織GPR120蛋白表達比較 GPR120蛋白在細胞膜呈陽性表達為主，部分于細胞質呈陽性表達，以黃色、棕黃色著色為主(圖1見封3)；乳腺癌組織GPR120蛋白陽性表達率為90.4%(113/125) 高于癌旁正常組織的31.7%(20/63)(P<0.01)，見表1。

表1 乳腺癌組織及癌旁正常組織中GPR120蛋白表達比較 [例(%)]

2.2 GPR120蛋白在乳腺癌不同分子分型中的表達比較 在HER-2過表達型和TNBC型乳腺癌中GPR120蛋白的陽性表達率比Luminal型乳腺癌中的表達較高，但是在這4種不同的乳腺癌分子分型中，GPR120蛋白的陽性表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 不同臨床病理特征患者GPR120蛋白表達比較 GPR120蛋白表達在乳腺癌不同病理類型中比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而在不同年齡、絕經狀態、組織學分級、病理分期、腫瘤大小以及淋巴結轉移等之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 GPR120蛋白在乳腺癌不同分子分型中表達比較 [例(%)]

表3 乳腺癌患者不同臨床病理特征GPR120蛋白表達比較 [例(%)]

2.4 不同乳腺癌標記物表達患者中GPR120蛋白表達比較 GPR120蛋白表達在不同ER和Ki-67表達患者中比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而在不同PR、AR及HER-2表達患者中比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

2.5 GPR120蛋白表達與腫瘤標志物相關性分析 經進一步相關性分析，GPR120蛋白表達與Ki-67的表達呈正相關(r=0.220，P=0.014)，與ER的表達呈負相關(r=-0.232，P=0.009)，與病理類型無相關性(r=-0.240，P=0.07)。

表4 在乳腺癌常規檢測分子標記物中GPR120蛋白表達比較 [例(%)]

3 討 論

近年來已有不少關于GPR120與惡性腫瘤組織發生發展的相關研究。有學者先后研究了前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌，研究數據證實ω-3脂肪酸對前列腺癌細胞的抑制作用可以由FFAR介導，且主要由GPR120介導，首次確定了卵巢癌細胞中FFARs的潛在抑制作用[6-8]。

本研究采用免疫組織化學染色法證實了GPR120蛋白在人乳腺癌組織中表達，與之前多項研究FFA4在乳腺癌細胞株中表達的結果相一致[9]。根據免疫組化染色的結果統計分析GPR120蛋白在人乳腺癌組織中及癌旁正常乳腺組織中表達的差異，本結果顯示，在乳腺癌中GPR120蛋白的陽性表達率為90.4%，明顯高于癌旁正常組織，與Zhu等[10]研究結果一致。這一結果提示在乳腺癌組織中GPR120可能起著促進腫瘤進展的作用，作為癌癥治療藥物靶點的潛在作用，同時有助于實現個體化治療。

常規的乳腺癌分子生物學指標不僅能夠預測腫瘤對臨床治療的反應，還能夠幫助臨床判斷腫瘤患者的預后。本研究依照GPR120蛋白的表達，對乳腺癌常規檢測的分子指標之間的關系進行統計學分析結果顯示，GPR120在乳腺癌組織中的表達與ER以及Ki-67的表達具有相關性，且差異有統計學意義，與PR、AR、HER-2的表達無統計學意義；ER的表達可作為一項判斷乳腺癌患者預后是否良好的指標，ER陰性的乳腺癌患者提示預后較差。Ki-67作為增殖相關的核抗原，其表達率越高則提示著預后越差[11]。本實驗結果顯示GPR120蛋白的表達與Ki-67的表達呈正相關，且在ER陰性的乳腺癌組織中的表達明顯高于ER陽性乳腺癌組織，由此可推測GPR120陽性乳腺癌患者的預后可能會較陰性患者的預后差，這預示著GPR120的表達與否可作為判斷乳腺癌患者預后是否良好的指標。之前的研究報道顯示乳腺浸潤性小葉癌有更良好的生物學表型，如更多的ER陽性、Ki-67的低表達[12]，本研究隨后綜合GPR120蛋白的表達情況，統計分析了其與臨床病理特征的相關性，分析結果顯示GPR120蛋白的表達與乳腺癌的病理類型狀態具有相關性，其在浸潤性導管癌和其他類型乳腺癌中陽性表達較高，在浸潤性小葉癌中的表達較低,該結果預示著GPR120在乳腺癌組織中可能存在促進作用，導致乳腺癌疾病的進展。

研究進一步分析了GPR120蛋白在不同分子分型乳腺癌之間的表達情況，數據顯示HER-2過表達型和TNBC型較Luminal型的乳腺癌GPR120蛋白的陽性表達率高，但在4種不同的乳腺癌分子分型中,GPR120蛋白的陽性表達差異無統計學意義，可能由于本次研究樣本量相對較小，后續仍需要更多的研究去證實其在分子分型之間的意義。

綜上，本研究發現，GPR120蛋白在乳腺癌癌組織中的表達顯著高于其在癌旁正常組織中的表達；相比以前的實驗研究，本研究首次發現乳腺癌組織中的GPR120蛋白的表達與Ki-67的表達及ER的表達有相關性，這一結果表明GPR120或可作為乳腺癌患者不良預后的預測指標；另外數據顯示HER-2過表達型和TNBC型較Luminal型的陽性率高，雖然差異無明顯統計學意義，但可能由于不同分子分型樣本量相對較小所致，后續仍需要更多的研究去證實其在分子分型之間的意義；另外研究納入人群均為可手術乳腺癌患者的組織標本，對于病理Ⅳ期的乳腺癌患者中GPR120的表達仍待確定；其次，研究僅依據GPR120蛋白的表達與乳腺癌常規檢測分子標記物之間的相互關系，大膽地推測GPR120的高表達或可作為乳腺癌患者不良預后的預測指標，但是并未對納入患者進行后期的追蹤隨訪，以探究其與患者的無病生存時間、五年生存率及總生存率的關系。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

郭文靜：設計研究方案，實施研究過程，分析整理數據以及論文撰寫；伍春梅、居琦：參與文章的修改；李金平：提供研究方向、研究思路及研究選題，分析試驗數據及論文審核