異補骨脂素對氧化應激介導骨質疏松大鼠模型的作用及機制

王軍，王劍，魯敏，牧亭亭，耿亞會

骨質疏松(OP)是臨床最常見的全身性骨骼疾病，目前已成為一個全球性的健康問題[1]。OP可分為原發性和繼發性2類，其中繼發性占比較大，患者主要表現為骨量降低、骨組織微結構受損及骨脆性增加，易骨折，因此其致殘率較高，給患者日常生活帶來嚴重影響[2-3]。不少研究證實，氧化應激(OS)是引發OP的根本原因之一，糖皮質激素會導致機體OS反應，使生理功能受阻，長期大劑量的糖皮質激素使用會誘發繼發性OP[4-5]。臨床上治療OP常采用抗骨吸收或促骨形成類藥物，但其對OS介導的OP療效并不理想，因此從抗OS方面尋求新型治療OP的藥物十分重要[6]。異補骨脂素是一種從豆科植物中提取的香豆素類化合物，具有防治OP的作用[7]。本研究通過動物實驗，探討異補骨脂素對OS介導的OP的治療效果，以期為其防治提供新的思路，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物： 健康大鼠[動物批準號：SCXK(京)2018-0013]40只，雌性，月齡8個月，體質量(210±10)g，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養于清潔級實驗室中，所有大鼠自由攝食飲水。

1.1.2 試藥試劑： 骨鈣素(OCN)、骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、骨保護素(OPG)、可溶性核因子κB受體活化因子配體(sRANKL)及抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)試劑盒由英國IDS公司提供，過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)及脂質過氧化產物丙二醛(MDA)檢測試劑盒均由寧波博泰生物技術有限公司提供，β-catenin抗體、FoxO3a抗體和Axin2抗體均由美國Santa Cruz公司提供，Trizol總RNA提取試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司，Western-blot及凝膠電泳試劑均購自南京凱基生物有限公司，醋酸潑尼松購自浙江仙琚制藥股份有限公司，異補骨脂素購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設備：骨密度儀(XR-46型，美國 NORLAND公司生產)、電子天平(AEL-40SM型，日本島津公司生產)、半自動圖像分析儀(BioDent/OsteoProbe型，美國OsteoMesure公司生產)、全自動酶標儀(Read Max 1900Plus型，上海閃譜生物科技有限公司生產)、MTS材料測試系統(858 Mini Bionix型，美國MTS公司生產)、顯微鏡(Olympus IX71型，日本OLYMPUS公司生產)、電泳儀(Bio-RaD型，美國Bio-Rad公司生產)、離心機(Allegra 64R型，美國貝克曼庫爾特公司生產)。

1.2 造模與分組 2017年9月—2018年10月在內蒙古自治區人民醫院動物實驗室進行實驗， 健康大鼠40只隨機數字表法分為模型組和干預組，各20只。醋酸潑尼松以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成0.5 mg/ml濃度的藥液，2組大鼠每日給予10 ml·kg-1·d-1，灌胃，連續14周。自造模之日起，干預組大鼠每日上午給予醋酸潑尼松，下午給予異補骨脂素混懸液25 mg·kg-1·d-1，每周停1天，連續治療14周，期間密切觀察各組大鼠的生理反應及生活情況。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 血清骨轉換指標檢測： 14周時各組大鼠末次灌胃后，禁食24 h，10%水合氯醛腹腔麻醉后，右心室徹底抽血處死，血標本離心取上清，-80℃備存待測。ELISA 法檢測各組大鼠血清BAP、OCN、TRACP5b、sRANKL和 OPG水平，嚴格按照說明書操作要求進行。

1.3.2 骨樣本留取：大鼠處死后，取兩側股骨、兩側脛骨和第4腰椎體(L4)，剔除周圍附著的肌肉及筋膜后，采用0.9%氯化鈉溶液沖洗，醫用紗布包裹，外面包裹一層錫紙，-80℃備存待測。

1.3.3 骨組織氧化應激水平檢測：將脛骨樣本采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)灌洗至骨干變白，收集灌洗液，離心后PBS重懸，調整骨髓細胞密度為2×106/ml，接種在6孔板中，無血清培養液37℃下培養箱內孵育30 min，采用DCFH-DA熒光探針進行氧化應激水平檢測。

1.3.4 骨密度及骨組織形態計量學分析：(1)骨密度。采用骨密度儀對各組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度進行檢測；(2)骨組織形態計量學分析。取右側股骨樣本解凍后，置于MTS試驗機上采用三點彎曲法進行生物力學檢測[8]，通過儀器記錄彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷，并計算剛性系數。

1.3.5 骨組織FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表達水平檢測：取右側股骨樣本解凍后，碾碎倒入勻漿器，加入裂解液混勻，按照Trizol總RNA 提取試劑盒說明書進行操作，提取總蛋白，-80℃下凍存;將總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離蛋白，然后轉印到PVDF膜上，置入封閉液中搖動1 h，加入一抗(PFoxO3a、β-catenin和Axin2抗體均為1∶500稀釋)孵育，4℃下過夜。二抗孵育(1∶2 000稀釋)2 h，免疫熒光增強法顯色，采用Western-blot法檢測骨組織FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表達，以其與GAPHD的灰度比值表示。

2 結 果

2.1 2組大鼠血清骨轉換指標比較 與模型組比較，干預組大鼠14周后的BAP、OCN、OPG明顯升高，sRANKL和TRAP5b明顯下降(P<0.01)，見表1。

2.2 2組大鼠骨組織氧化應激水平比較 干預組大鼠CAT及SOD水平明顯高于模型組，MDA水平明顯低于模型組(P<0.01)，見表2。

表2 2組大鼠骨組織氧化應激水平比較

2.3 2組大鼠的骨密度情況比較 14周后，干預組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型組(P<0.01)，見表3。

表3 2組大鼠的骨密度比較

2.4 2組大鼠骨生物力學性能比較 三點彎曲檢測大鼠股骨干的生物力學參數，結果顯示，干預組大鼠的彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷及剛性系數較模型組明顯上升(P<0.01)，見表4。

表4 2組大鼠骨生物力學性能比較

2.5 2組大鼠骨組織FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表達比較 與模型組大鼠比較，干預組FoxO3a和Axin2蛋白水平下調，β-catenin蛋白表達明顯增加(P<0.01)，見表5、圖1。

表5 2組大鼠骨組織相關蛋白表達水平情況比較

表1 2組大鼠血清骨轉換指標比較

注：1～4為模型組，5～8為干預組

3 討 論

OP是在老年人群中發病率較高的一種全身性骨骼疾病，并給老年人生活質量帶來嚴重影響。近些年衰老的“OS理論”在肝病、腎病、心血管疾病及腫瘤等疾病的研究中被廣泛應用，但在OP方面尚處于初步研究階段[9]。機體衰老時，代謝系統會產生較多的前氧化劑，從而對機體細胞產生氧化損傷，當其損傷積累到一定程度時，會發生OS反應，最終導致機體發生與衰老相關的退行性疾病。骨組織屬于人體第三大最易衰老組織，OS會對骨髓干細胞分化成骨細胞產生抑制，同時會促進破骨細胞的分化，從而誘導OP的發生[10-11]。長期大量使用糖皮質激素會導致機體高OS狀態，從而導致繼發性OP。大鼠是OP動物模型最常用的動物，其模型具有穩定性好、重復性高的優點，利于學者對OP的發生機制及防治進行探索。本研究通過醋酸潑尼松誘導建立OS介導OP大鼠模型進行實驗研究，對研究人類OS介導 OP有著積極的指導意義。

尋找和篩選中藥中抗氧化及衰老的成分研究一直來都是熱點。天然抗氧化劑在植物中存在繁多的種類，在各種慢性病的防治方面有著重要作用[12]。異補骨脂素是從豆類植物中提取的一種化學活性成分，具有溫脾止瀉及溫補腎陽功效，現代藥理研究認為，異補骨脂素可促進成骨細胞增殖，抑制骨吸收[13]。OCN是由成骨細胞分泌的一種功能性蛋白，可反映機體成骨細胞的活動狀態[14]。BAP主要存在于機體肝臟和骨骼上，是成骨細胞的表型標志物之一[15]。OPG為破骨細胞分化因子的誘導受體，可減少破骨細胞的產生[16]。本研究結果顯示，干預組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型組，干預組大鼠的BAP、OCN、OPG明顯升高，sRANKL和TRAP5b明顯下降(P<0.01)。這說明異補骨脂素可能發揮類似雌激素作用，促進雌激素受體陽性細胞增殖，調節成骨分化，從而維持骨密度，并促進成骨細胞產生，緩解OP癥狀。

骨折是OP的嚴重并發癥，通過檢測骨組織力學特征，可有效評價OP的嚴重程度[17]。本研究通過股骨三點彎曲試驗，結果顯示，干預組大鼠的彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷及剛性系數較模型組明顯上升(P<0.01)，說明經過異補骨脂素治療，可抵消OS介導OP對骨生物力學的硬性，增強大鼠的骨組織抵抗變形能力，提高其骨生物性能，降低骨折的發生風險。機體在新陳代謝過程中會產生活性氧自由基(ROS)，在正常狀態時，機體內抗氧化劑和各種酶與ROS呈一個動態的平衡，當這種平衡被打破時，會發生OS反應，從而使纖連蛋白和膠原降解，對成骨細胞的正常分化產生抑制，并加速機體衰老[18]。SOD是機體內可清除超氧陰離子的一種抗氧化酶，可起到抗氧化作用[19]。CAT是一種可催化過氧化氫，分解成氧和水的酶，是過氧化物酶體的標志酶，是其他巰基蛋白質的保護劑[20]。MDA是ROS與不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的一種代謝終產物，其可以反映機體受ROS攻擊的嚴重程度[21]。本研究結果顯示，干預組CAT及SOD水平明顯高于模型組，MDA水平明顯低于模型組(P<0.01)。這是因為異補骨脂素具有抗氧化作用，可有效清除機體內過多的ROS，從而對維持細胞內環境穩定起到重要作用，逆轉OS反應，減輕機體受氧化損傷的程度。

FoxO是一種可調控OS的最重要蛋白，可包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4及FoxO6，其中FoxO3a在骨組織中廣泛存在[22]。Wnt信號通路在成骨細胞分化和增殖中起重要作用，β-catenin蛋白是Wnt信號通路的主要成分，可啟動Wnt信號通路[23]。Axin2是一種可抑制Wnt 信號通路激活的骨架蛋白[24]。本研究顯示，干預組FoxO3a和Axin2蛋白水平下調，β-catenin蛋白表達明顯增加(P<0.01)。這可能是因為OS會促進FoxO3a通路激活，并加重OS，同時引起成骨組織細胞凋亡，抑制成骨分化功能，異補骨脂素通過抗氧化作用，可抑制FoxO3a信號通路激活；同時上調β-catenin蛋白表達，使其與FoxO3a結合，啟動調節骨組織細胞凋亡及清除 ROS的轉錄程序，促進成骨細胞的形成和骨形成，通過清除過多的ROS，實現對Axin2的表達下調，抑制Axin2/PPARγ信號通路參與脂質代謝，阻斷Axin2對Wnt信號通路的抑制，起到防治OP的作用。

綜上所述，OS會引起并促進OP的病理進程，而異補骨脂素可通過抗氧化作用，調控FoxO3a/Wnt信號通路發揮OS介導OP的作用。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

王軍：整理資料，分析資料，撰寫論文；王劍：修改總指導；魯敏：收集整理資料，分析數據，圖表設計；牧亭亭、耿亞會：參考書籍查找，收集資料