辣椒枯萎病土壤拮抗真菌的篩選與鑒定

莫維弟，卯婷婷

(1.貴州大學 農學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省農業科學院 植物保護研究所， 貴州 貴陽 550006)

辣椒產業是貴州省最重要的特色農業產業之一，據統計，至2018年，貴州辣椒種植面積為36.7萬hm2，居全國首位[1]。隨著辣椒種植面積的不斷擴大和連年種植，土傳病害發生日益嚴重，如由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的辣椒枯萎病近幾年發生頻繁，嚴重影響貴州辣椒的生產，對辣椒種植戶造成了巨大的經濟損失。尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)屬半知菌類叢梗孢目瘤座孢科鐮刀菌屬(Fusarium)，是引起辣椒枯萎病的病原真菌，其既可侵染辣椒又可在土壤內生存。生產上對辣椒枯萎病的防治多以化學防治為主，但由于化學農藥使用不合理極易引起作物藥害，導致病原物產生抗藥性，人畜中毒及殺傷有益微生物等不良作用。同時，農藥的高殘留造成環境污染，危害人類健康并破壞生態平衡。近年來，人們對食品安全的要求越來越高，化學防治已經不能滿足食品安全性的需求。為此，尋求安全有效的防治措施已成為一個亟待解決的問題。

生物防治具有對環境無污染、對人畜無毒、對植物無副作用，不易產生抗藥性等優點，可克服化學農藥帶來的弊病，尤其適用于土傳病害的防治。其既符合人們對綠色食品的需求，又可為農業的可持續發展提供保障，現已成為防治辣椒枯萎病的研究熱點。梁建根等[2]研究表明，生防菌株B-3的發酵液及其濾液對辣椒枯萎病菌均表現出較好的抑制作用，對盆栽與大田辣椒枯萎病的防效分別為73.6%和64.8%，顯著優于100 mg/L多菌靈。馬利平等[3]平板對峙試驗結果表明，B96-II發酵液(1010～1011cfu/mL)對辣椒枯萎病菌有明顯的抑制作用，濃度稀釋100倍以上 (108～109cfu/mL)可完全抑制該病菌的生長。此外，據報道，鏈霉菌、綠膿桿菌、粘質沙雷菌和莢殼布克氏菌對尖孢鐮刀菌都具有明顯的抑制作用[4]。鑒于此，以辣椒枯萎病菌為靶標菌，從土壤中篩選對辣椒枯萎病具有拮抗作用的真菌，并對抑制效果好的菌株進行分子生物學鑒定和形態學鑒定，以期為辣椒枯萎病的生物防治研究提供有效的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌 分別為辣椒枯萎病、辣椒疫病、辣椒炭疽病、辣椒根腐病、茶輪斑病和獼猴桃軟腐病的病原菌，共6株菌株(表1)，均由貴州省農業科學院植物保護研究所生物防治研究室提供。

表1 供試病原菌信息

1.1.2 土樣采集 2017年6月以5點取樣法在貴州省荔波縣茂蘭鎮不同生境和不同種植作物地塊中采集根際土壤，每個點取1份，共5份，每份100 g。土樣信息詳見表2。

表2 荔波縣茂蘭鎮土樣采集地信息

1.1.3 試劑 葡萄糖，成都金山化學試劑有限公司；瓊脂，上海博微生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；50倍TAE、瓊脂糖，上海碩欣生物科技有限公司；GelRed，北京索萊寶科技有限公司；真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，生工生物工程(上海)股份有限公司；2×Es Taq Master Mix，北京天根生物技術有限公司。

1.1.4 培養基

1) PDA培養基。馬鈴薯200 g洗凈、去皮，加1 000 mL蒸餾水煮沸30 min，取濾液，加入瓊脂18 g+葡萄糖20 g+蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH。

2) PD液體培養基。用量和做法同PDA，但不加入瓊脂，自然pH。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化 參考文獻[4]的方法采用稀釋分離法分離土壤中的真菌。稱取土樣10 g，加入裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，放入無菌玻璃球 ，于25℃ 160 r/min搖床中震蕩培養30 min。在超凈工作臺內，用移液槍吸取1 mL的土壤懸浮液放入裝有9 mL無菌水的滅菌試管中，充分搖勻后得到濃度為10-1的土壤懸浮液。采用梯度稀釋法依次獲得濃度為10-2和10-3的土壤懸浮液。用移液槍分別吸取100 μL濃度為10-2和10-3的土壤懸浮液放入PDA平板中，用無菌三角玻璃棒均勻涂開，靜置60 s后放到25℃的恒溫培養箱中黑暗倒置培養，24 h 后開始觀察，一旦平板中有單個菌落形成，立即純化保存菌株，并對每個菌株進行編號。3次重復。

1.2.2 辣椒枯萎病生防菌的篩選

1) 對峙法初篩。參照文獻[5]的方法采用對峙培養法篩選對辣椒枯萎病(尖孢鐮刀菌)具有拮抗作用的菌株。將活化的尖孢鐮刀菌和從土壤中分離得到的待測真菌，用直徑為5 mm的打孔器沿菌落邊緣分別打取菌餅，然后將2菌餅分別接種于同一PDA平板上，間距為5 cm。以只接種尖孢鐮刀菌的PDA平板作為對照，3次重復。25℃恒溫暗培養7 d后，測量病原菌菌落半徑，計算每個待測菌株的生長抑制率。

生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/ 對照菌落直徑×100%

2) 抑菌圈法復篩。挑取對峙初篩中抑菌效果較好的菌株進行復篩。將活化培養5 d的尖孢鐮刀菌用無菌水洗脫制成1×10-6cfu/mL的孢子懸液，吸取5 mL加入到50 mL 50℃左右的PDA培養基中混勻，然后倒平板備用。取直徑5 mm的初篩拮抗菌菌餅接種于平板中央，放于25℃箱中倒置暗培養5 d，觀察并記錄抑菌圈直徑。

1.2.3 拮抗菌株對病原菌的拮抗性測定 將辣椒疫病(Phytophthoracapsici)、辣椒炭疽病(Colletotrichumcapsici)、辣椒根腐病(Fusariumsolani)、茶輪斑病(Pestalotiopsistheae)及獼猴桃軟腐病(Phomopsissp)等5種靶標病原菌進行PDA平板活化。采用平板對峙法將活化的病原菌株與1.2.2復篩得到的拮抗菌株進行對峙培養，以只接種5種標靶病原菌的PDA平板作為對照，計算拮抗菌株對各種病原菌的生長抑制率，確定其是否具有拮抗廣譜特性。

1.2.4 拮抗菌株的鑒定

1) 形態學鑒定。將復篩得到的拮抗菌株接種到PDA平板中央，25℃恒溫箱培養7 d后，觀察菌落形態、生長狀況和顏色；用接種針在菌落邊緣挑取少量菌絲放于純水中制片后放于光學顯微鏡下觀察其產孢結構及分生孢子等的形態特征，并采集圖片。

2) 分子生物學鑒定。參照文獻[6-7]的方法用真菌DNA提取試劑盒提取待測菌株的基因組DNA，然后用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μL：DNA模板(1 μL)、2×Es Taq Master Mix(12.5 μL)、通用引物ITS1(1 μL)、ITS4(1 μL)、dd H2O (9.5 μL)；PCR擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 數據統計

采用 SPSS 19.0 進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

2.1.1 初篩 從采集5個土樣中共分離到真菌菌株61株，經對峙初篩獲得對尖孢鐮刀菌抑制率≥50%的拮抗菌11株(表3)，其中，菌株LB010402的初篩抑制效果最佳(圖1)，其對尖孢鐮刀菌的生長抑制率為60.47%，顯著高于其余菌株；菌株LB010302其次，其生長抑制率為56.25%，顯著高于除菌株LB010402和LB010307外的其余菌株；菌株LB010401和LB010308的生長抑制率相對較低，分別為50.00%和52.03%，二者差異顯著，且均顯著低于其余菌株；菌株LB010309、LB010310及LB010301等6株菌株與菌株LB010307間差異不顯著。

表3拮抗菌株對尖孢鐮刀菌的抑制作用

Table 3 Inhibition effect of antagonistic fungus strains againstF.oxysporum

菌株Strain尖孢鐮刀菌生長直徑/mmMycelia growth diameter of F. oxysporum尖孢鐮刀菌抑制率/%Inhibition rate against F. oxysporumLB01030943.00±0.8253.76±1.76 cLB01031043.00±1.4153.76±3.04 cLB01030143.33±1.5553.41±3.32 cLB05030141.67±0.9454.04±2.08 cLB04030242.33±0.4753.31±1.04 cLB01030239.67±2.0556.25±4.53 bLB01030445.33±0.8554.05±1.72 cLB01040149.33±1.5550.00±3.13 eLB01030744.67±0.6254.73±1.26 bcLB01030847.33±0.2452.03±0.48 dLB01040239.00±0.4160.47±0.83 aCK98.67±0.850.00

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters after the data in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level. The same below.

注： a，菌株LB010402與尖孢鐮刀菌對峙培養正面; b，菌株LB010402與尖孢鐮刀菌對峙培養背面。

Note: a, the obverse of strain LB010402 andF.oxysporumconfrontation culture. b, the reverse of strain LB010402 andF.oxysporumconfrontation culture.

圖1菌株 LB010402與尖孢鐮刀菌對峙培養的菌落形態

Fig.1 Colony morphology of LB010402 andF.oxysporumconfrontation culture

2.1.2 復篩 在對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用(生長抑制率≥50%)的11個菌株中，LB010402菌株的抑菌效果最明顯，在第5天時其抑菌圈直徑達31.5 mm(圖2)，且抑菌圈邊緣菌絲變薄。推斷菌株LB010402有可能使尖孢鐮刀菌菌絲消解或斷裂。因此，選取菌株LB010402進行進一步試驗。

圖2菌株LB010402在尖孢鐮刀菌PDA培養基上形成的抑菌圈

Fig.2 Inhibition zone formed by LB010402 onF.oxysporumPDA culture medium

2.2 菌株LB010402對5種病原菌的拮抗性

從表4看出，菌株LB010402對辣椒疫病、辣椒炭疽病、辣椒根腐病、茶輪斑病及獼猴桃軟腐病等的靶標病原菌均具有較好的拮抗作用，其生長抑制率均≥50%。其中，對辣椒疫霉病菌和獼猴桃軟腐病菌的抑菌效果較好，抑菌率達64.17%和61.66%，對茶輪斑病菌、辣椒炭疽病菌和辣椒根腐病菌的抑菌率分別為58.65%、51.42%和50.83%。說明該拮抗菌株具有一定的廣譜性。

表4菌株LB010402對5種病原菌的抑制作用

Table 4 Inhibition effects of Strain LB010402 against five target pathogens

受試靶標菌Target pathogen菌株生長直徑/mmGrowth diameter of target pathogens處理對照(CK)對靶標菌的生長抑制率/%Inhibition rate against target pathogensPhytophthora capsici38.33±1.93107.00±1.0064.17±3.61 dPhomopsis sp.40.00±1.78104.33±0.4761.66±3.41 cFusarium solani44.00±0.82 88.67±0.2450.38±1.84 aPestalotiopsis theae36.67±0.62 91.33±0.6259.85±1.37 bColletotrichum capsici40.00±2.86 82.33±0.4751.42±6.94 a

2.3 拮抗菌株LB010402的鑒定

2.3.1 形態學特征 從圖3可見，菌株LB010402在PDA培養基上生長5 d后形成淺黃褐色菌落，菌絲呈羊毛狀；生長10 d后菌絲聚結逐漸形成黑色子囊果，黑色子囊果呈圓形或卵圓形，黑褐色，直徑為150～265 μm，上著生許多附屬絲；子囊果破裂后釋放出大量子囊孢子，呈橢圓形或檸檬形，孢子大多兩端呈突起狀，褐色至黑褐色，大小為(8.6～11)μm×(6～7.5)μm。該菌的培養及顯微形態特征與許秀蘭等[8-10]報道的球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)特征基本相符。

注：a，PDA平板上菌株LB010402的菌落正面(左)和反面(右)形態；b，子囊果；c，子囊孢子。

Note: a, the colony obverse (left) and reverse (right) morphology of strain LB010402 on PDA; b, ascocarp; c，ascopore.

圖3菌株LB010402的形態特征

Fig.3 Morphological characteristics of Strain LB010402

2.3.2 分子生物學鑒定 PCR擴增菌株LB010402的ITS全場序列，獲得一段長度約600 bp的DNA片段。經與GenBank中的基因序列進行比對發現，其與球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)(Genbank登錄號KM268639.1)的同源性最高，達99.81%。從圖4可見，根據ITS序列構建的毛殼菌屬(Chaetomium)分子系統發育樹，菌株LB010402與球毛殼菌(C.globosum)聚在一個子分支上，支持率達96%。綜合其形態學特征與分子生物學鑒定結果，確定菌株LB010402為球毛殼菌(C.globosum)。

圖4 根據ITS序列建立的系統發育樹

3 結論與討論

該研究從貴州省荔波縣不同生境土樣中篩選到1株真菌LB010402，經形態學和分子生物學鑒定，其為球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)。目前關于球毛殼菌的研究主要集中在其次級代謝產物[11-15]方面，此外，也有關于其生物防治分子機理方面的研究和作為優良生物防治基因克隆理想生物材料[16]方面的研究。

球毛殼菌菌株LB010402對辣椒枯萎病有較好的拮抗作用，其抑制率為60.47%；同時，其對辣椒疫霉病菌、獼猴桃軟腐病菌和茶輪斑病菌也有較好的抑制作用，其抑制率分別為64.17%、61.66%和59.85%，說明該菌株具有較好的廣譜性。但由于田間土壤環境復雜，具有不定性因素，因此，在室內篩選到的拮抗真菌在大田的防治效果需要進一步通過大田試驗進行研究。

生物防治是病害防治中一種重要且行之有效的防治手段[17]，相較于化學防治而言，既經濟有效又綠色環保。生物防治不僅可以解決農藥帶來的“3R”問題，還能滿足人們對食品安全的需要。辣椒是我國大部分地區飲食中不可缺少的原料，采用生物制劑進行辣椒枯萎病防治，不僅符合人們對綠色食品的需求，而且為農業的可持續發展提供了保障。該研究篩選的拮抗真菌可為辣椒枯萎病的生物防治提供有效的菌種資源。