鐮刀菌引起的西瓜猝倒病病原鑒定

王芳 劉秀杰 劉繼秀 高美玲

摘? ? 要：為明確齊齊哈爾市郊區西瓜繁育基地西瓜幼苗猝倒的發病原因及為西瓜苗期病害防治提供依據，從發病區采集病樣進行病原鑒定。結果分離獲得12個菌株，根據培養特征和形態學特征，確定分離到的菌株為尖孢鐮刀菌（Fusaruim oxysporum）;利用真菌通用引物ITS1/ITS4擴增菌株rDNA-ITS序列，GenBank數據庫BLAST同源比對與F. oxysporum一致性達99%。將分離到的菌株回接到健康西瓜幼苗上，植株表現出與田間相似發病癥狀。基于形態學、分子生物學及致病性檢測，最終確定齊齊哈爾市郊區育苗基地西瓜猝倒病的病原菌為Fusaruim oxysporum。

關鍵詞：西瓜猝倒病;鐮刀菌;形態學特征;rDNA- ITS

Abstract：Watermelon seedlings with damping off symptom was found in Qiqihar suburban breeding base. In order to identify the cause of disease， samples were collected from the diseased area. A total of 12 strains were isolated and identified as Fusaruim oxysporum according to the characteristics of culture and morphology. The sequence of rDNA-ITS was amplified using primers ITS1/ITS4， and BLAST homologous alignment in GenBank database was 99% consistent with that of F. oxysporum The isolated strains were inoculated to healthy watermelon seedlings and the plants showed symptoms similar to those in the field. Based on morphology， molecular biology and pathogenicity detection， Fusaruim oxysporum was identified as the pathogen of watermelon damping off in Qiqihar city suburban breeding base.

Key words：Watermelon damping off; Fusaruim oxysporum; Morphological features; rDNA- ITS

西瓜是人們夏季消熱解暑的主要水果之一，在黑龍江省齊齊哈爾地區已有上百年的種植歷史，市下轄的每個區、縣幾乎都有西瓜栽培，種植方式主要以育苗移栽為主。由于育苗期間苗床土壤低溫、高濕，幼苗處于易感病階段，利于病菌侵入，加之苗床管理不當，易發生病害。

猝倒病是作物苗期的主要病害之一，可由多種土傳病菌和種傳病菌真菌侵染引起，如絲核菌屬（Rhizoctonia）、鐮刀菌屬（Fusarium）、腐霉屬（Pythium）、疫霉屬（Phytophthora）等[1-5]。該病害也是西瓜苗期常見病害，但關于該病害的研究及報道相對較少。2012年，曾蓉等[6]從上海金山區的西瓜幼苗猝倒樣本中分離到腐霉（Pythium spp.）。葉愛華[7-8]報道瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum（Edson）Fitzp]和德里腐霉（Pythium deliense Meurs）均可引起西瓜猝倒，并也能引起大棚菠菜幼苗猝倒。

2018年5月，黑龍江省齊齊哈爾市郊區西瓜繁育基地發現西瓜幼苗猝倒，發病率達30%。受害幼苗莖基部呈黃褐色水漬狀病斑，后期倒伏、枯死，導致移栽苗數不夠，西瓜成熟期不一致，影響生產。為明確西瓜猝倒病的病因，筆者對該地區西瓜幼苗猝倒病的分離純化菌進行形態學和分子鑒定，以及致病性測定，旨在明確西瓜猝倒病病原菌的主要種類，為該病害的防治及抗病育種工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病株采集

2018年5月，對黑龍江省齊齊哈爾市郊區西瓜繁育基地進行西瓜幼苗猝倒病發病癥狀的觀察及取樣，調查包括病斑顏色、大小、部位和發病率。

1.2 病原菌分離與純化

參照方中達組織分離法進行病原菌分離[9]。將患病幼苗先用流水沖洗，在植株病健交界處剪取3～5 mm根段數塊，然后用70%的乙醇表面消毒30 s，放入無菌水中連續清洗3次，接種到PDA平板上，25 ℃恒溫培養。5 d后觀察并記錄分離物的類別和出現率。選取菌絲邊緣接種到新的PDA平板上純化培養，將純化的菌株接種于PDA試管斜面培養基上4 ℃保存。

1.3 病原菌形態學特征鑒定

從純化的病原菌培養基上，挑取菌絲邊緣置于新的PDA培養基上，25 ℃恒溫培養7 d，十字交叉法測量菌落生長直徑，觀察菌落形態、色素顏色、菌落生長速率及邊緣生長情況。隨機選大、小分生孢子各50個測量大小，顯微鏡下鏡檢大、小分生孢子、厚垣孢子及分生孢子梗的的形狀及著生方式。根據BOOTH [10]分類系統進行形態學鑒定。

1.4 病原菌分子生物學鑒定

供試菌株接種在PDA 培養基上，25 ℃恒溫培養7 d，取 0.2 g菌絲體，加入液氮研磨，采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取病原菌基因組DNA。經1%凝膠電泳檢測合格后，將其作為ITS區DNA擴增的模板。ITS區序列PCR擴增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），預計分別擴增約540 bp。PCR反應體系為25 μL，包括：DNA模板1 μL，2× Taq PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol·L ITS1 1 μL，10 μmol·L ITS 4 μL，dd H2O補至25 μL。擴增條件為：95 ℃預變性5 min，然后進行35個擴增循環即 95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增后的PCR產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1.5 病原菌致病性測定

采用浸根法對代表分離菌株進行回接。先將西瓜種子用5%的NaClO溶液消毒10 min，55 ℃溫湯浸種后，置25 ℃溫箱催芽。待種子發芽并長到3～5 cm時將發芽種子移入小燒杯內，注入孢子懸浮液（濃度為1.0×106 個·mL），浸根時間為30 min，以清水作為對照。3次重復，每次重復5株。接種后，幼苗轉入25～27 ℃溫室培養。14 d后調查病害發生情況，并進行病原菌的重新分離及鑒定。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

西瓜猝倒病發生在幼苗出土至真葉展開時期，發病率在30%左右。幼苗出土后，葉片仍保持綠色時就出現倒伏現象。取出病株可見莖基部或根部呈黃褐色水漬狀病斑，后期莖基部呈縊縮（圖1）。

2.2 病原菌形態鑒定

觀察PDA平板正面，菌落呈白色，菌絲生長茂盛、密集，平均每天生長0.8 cm，氣生菌絲絨毛狀;培養基背面呈橙黃色，基物無色。小型分生孢子較多，橢圓形或腎形，0～2個隔膜，假頭狀著生在產孢細胞上，大小為（3.8～11.1） μm×（1.0～3.0） μm;大型分生孢子鐮刀形或紡錘形，3～4個隔膜居多，大小為（12.5～37.0） μm×（2.3～5.0） μm;厚垣孢子球形，單生或串生（圖2）。這些形態特征與Booth的鐮刀菌分類系統中尖孢鐮刀菌的形態特征基本一致，初步將具有這些形態特征的分離物鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusaruim oxysporum）。

2.3 病原菌rDNA-ITS序列分析

提取代表菌株XG1-1基因組DNA，利用真菌通用引物ITS1/ ITS4 PCR擴增rDNA-ITS序列，擴增序列片段大小分別為541 bp。在GenBank數據庫中序列進行BLAST比對分析，代表菌株XG1-1的ITS序列與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的相似性達99%（Genbank 登錄號JF807397）。根據供試菌株形態學特征及rDNA-ITS序列分析結果，將該菌株鑒定為尖孢鐮刀菌。

2.4 病原菌致病性測定

采用浸根法將分離物接種到西瓜幼苗根部。接種14 d后，發現幼苗子葉完好，但近地面處的莖基部或根莖部呈現出黃色至黃褐色水漬狀縊縮病斑，大多數幼苗呈現倒伏現象，與田間發病癥狀一致。取病健交界組織，進行病原菌分離，得到分離物與接種菌株形態相同，證明所接菌株為西瓜猝倒病的病原菌。

3 討論與結論

猝倒病是西瓜苗期常見病害之一，而病原學研究是防治病害的基礎，關于其病原鑒定的報道相對較少。已報道的病原菌有瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）和德里腐霉（Pythium deliense）。筆者從齊齊哈爾市郊區西瓜繁育基地的西瓜幼苗中分離到致病菌尖孢鐮刀菌F. oxysporum，致病性測定表明這種鐮刀菌也可侵染甜瓜幼苗。

尖孢鐮刀菌是一種土壤習居菌，既可以單獨侵染植物，也可以與其他鐮刀菌或其他病原菌共同作用混合侵染植物。該病原菌寄主范圍廣，可侵染松苗及棉花苗使幼苗猝倒;可危害成株期的西瓜及煙草、白菜、玉米等多種作物致使根腐或枯萎[11-15]。以往研究中，鐮刀菌屬病原菌的分類主要依據形態特征劃分，但分子生物技術及生物信息學的發展為一些形態相近的姊妹種和復合種的準確區分提供了可能，如 F. oxysporum Schlecht. ex Snyder et Hansen、F. solani （Martius） Appel et Wollenw. ex Snyder et Hansen、F. graminearum Schwabe等已被區分[16]。筆者利用形態學及DNA序列分析技術，并結合致病性檢測，明確引起齊齊哈爾市西瓜育種基地幼苗猝倒病病原菌為尖孢鐮刀菌，為西瓜苗期病害防控提供了理論依據。

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