基于全基因組重測序構建西瓜高密度遺傳 圖譜和果實相關性狀的基因定位

李兵兵 路緒強 豆峻嶺 高磊 趙勝杰 何楠 劉文革

目的與意義：遺傳圖譜是進行重要農藝性狀QTL/基因定位、圖位克隆、分子標記輔助育種等工作的重要工具。長期的人工選擇使得栽培種西瓜的遺傳基礎進一步狹窄，使得高效可獲得的分子標記成為限制西瓜高密度遺傳圖譜構建的重要因素。隨著高通量測序技術的發展和西瓜參考基因組草圖的組裝完成，通過測序獲得大量分子標記以構建高密遺傳圖譜成為可能。通過全基因重測序構建高密度遺傳圖譜，可以更快更準確的檢測重組斷點，開發大量適于遺傳圖譜構建的分子標記。最近幾年，陸續有多張西瓜遺傳圖譜發表。但這些圖譜大都基于簡化基因組測序，遺傳圖譜的飽和度相對不足;作圖群體多為臨時性分離群體，不能進行重復試驗，影響后續基因定位工作的準確性。筆者構建了重組自交系作為永久性作圖群體，通過對其進行全基因組重測序構建了一張西瓜高密度遺傳圖譜，并對果皮顏色、種皮顏色和果實苦味3個性狀進行了初定位，以期用于西瓜分子遺傳育種等工作。

材料與方法：以具有顯著性狀差異的自交系材料‘9904和‘Handel為親本，經過連續7代自交，構建了含126個單株的重組自交系。‘9904具有墨綠色果皮、淺黃色種皮、苦味果實; ‘Handel具有淺綠色果皮、黑色種皮、無苦味果實。采集西瓜植株幼嫩葉片，提取植物基因組DNA，質量檢測合格的DNA將用于測序建庫。高質量的DNA被隨機打斷為200～500 bp的片段，然后經過DNA片段末端修復、3端加A、添加測序接頭和進行純化、最后經PCR擴增等完成測序文庫的構建。文庫經嚴格的質量檢測后通過Illumina HiSeqTM測序平臺進行測序。完成標記的填補和校正后，根據子代重組情況進行bin劃分。將各樣本按照染色體物理位置排列整齊，當任何樣本出現分型轉變時認為出現重組斷點，然后將重組斷點間的SNP化為一個bin中。同時對bin進行偏分離過濾，對嚴重偏分離的標記進行過濾（P<0.001）。長度小于20 kb以下的bin被篩除，過濾掉非染色體上的bin，最后以bin為作圖標記進行遺傳圖譜的構建。使用MapQTL軟件結合重組自交系的表型對果皮底色、種皮顏色和果實苦味進行連鎖分析。

結果與分析：（1）通過對RIL群體和親本進行重測序，分別得到177.08 Gbp、7.67 Gbp和8.81Gbp的高質量數據。Q30超過85%，CG的平均含量接近35%。‘9904‘Handel和重組自交系群體測序的平均覆蓋深度為17 X、19 X和2.99 X。親本基因組平均覆蓋度均在99.42%以上，重組自交系平均覆蓋度在89.28%以上?；蚪M基本被覆蓋，整體分布均勻，說明測序的整體隨機性較好。（2）構建的西瓜高密度遺傳圖譜包含11條連鎖群，由2 132個重組bin標記組成，上圖SNP有103 029個，圖譜總長度1508.94 cM，平均圖距為0.74 cM（原圖2）。（3）共定位到3個顯著性位點（原圖6）：在1號染色體上定位到一個與果實苦味有關的位點qbt-c1-1，LOD值為58.361，位于Block876-Block1188之間，區間范圍為0-45.91 cM，解釋表型變異為82.927%。在3號染色體上定位到一個與種皮顏色有關的位點qrc-c3-1， LOD值為26.852， 位于Block3708-Block3722之間，區間范圍為31.705-32.505 cM，解釋表型變異為58.685%。在8號染色體上定位到一個與果皮顏色有關的位點qrc-c8-1， LOD值為18.353，位于Block8000-Block8110之間，區間范圍為142.728-154.742 cM，解釋表型變異為49.9425%。

結? ? 論：本研究構建了一張西瓜高密度遺傳圖譜，并對果皮顏色、種皮顏色和果實苦味等果實相關性狀進行了初定位分析，為果皮顏色、種皮顏色和果實苦味候選基因的精細定位及闡明其形成的分子機理等奠定了基礎，同時為西瓜分子標記輔助育種的提供了工具。