基于可視化環介導等溫擴增技術 快速、靈敏檢測瓜類蔓枯病菌

姚協豐 李蘋芳 徐錦華 張曼 任潤生 劉廣 羊杏平

目的與意義： 蔓枯病（gummy stem blight，GSB）是葫蘆科作物（比如哈密瓜、香瓜、黃瓜和西瓜等）的世界性病害，往往危害莖和葉，且通過溫室育苗和修剪被侵染植株而交叉感染傳播，也可通過種子帶菌傳播。在有利的環境條件下，低水平的潛在侵染苗有可能導致病害大流行。大棚內的高濕環境有利于瓜類蔓枯病發生，已成為瓜類生產中繼枯萎病之后最嚴重的病害之一。蔓枯病菌（Didymella bryoniae）是導致葫蘆科作物蔓枯病的病原，蔓枯病菌的早期診斷、靈敏、快速的檢測對于限制蔓枯病在溫室育苗或田間移栽的傳播具有重要意義。本研究基于環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP），建立可視化、快速、靈敏的瓜類蔓枯病菌檢測體系。

材料與方法： （1）對瓜類蔓枯病菌和其他對照菌株（蔓枯病菌、菜豆褐斑病菌、西瓜炭疽病菌、甜瓜鏈格孢葉斑病菌、葫蘆輪枝鐮孢菌、西瓜枯萎病菌0號生理小種、西瓜枯萎病菌1號西瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌2號生理小種）的菌絲真空干燥后采用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）試劑盒進行DNA提取。瓜類蔓枯病原菌人工噴霧接種甜瓜植株，收集接種甜瓜葉片和對照葉片，然后通過DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取DNA。（2）利用引物設計軟件網站（PrimerExplorer V4），根據來源于RAPD（random amplified polymorphic DNA）的標記（GenBank GQ872461，GQ872462）通過軟件設計LAMP特異性引物4組。設計的LAMP引物，包括一對內引物，一對外引物和后環引物。（3）LAMP反應的優化，選擇不同試劑，不同濃度優化最佳濃度：設計Bst DNA聚合酶量范圍 （2～8 U），dNTPs濃度范圍（2～10 mmol·L-1），鎂離子濃度范圍（2～8 mmol·L-1），引物濃度范圍（2～4 mmol·L-1），氯化錳濃度梯度（0.1～1.0 mmol·L-1），鈣黃綠素濃度梯度（2～8 mmol·L-1）。選擇LAMP最適反應溫度及最佳反應時間優化，設計溫度梯度：61 °C、62 °C、63 °C、64 °C、65 °C、66 °C、68 °C。設計LAMP反應時間梯度：60、45、30、15 min。LAMP反應特異性檢測，以5種不同蔓枯病菌（包括RAPD Group I和II）和7種葫蘆科病原菌及一種與蔓枯病菌同屬的菜豆褐斑病原菌，檢測LAMP引物特異性和區分度。LAMP反應靈敏度檢測，設計不同濃度梯度DNA為模板：105、104、103、102、10、1、10?1 濃度的DNA（fg·μL?1） ，LAMP和常規PCR的比較。LAMP方法最低檢測下限和常規PCR檢測下限比較。（4）LAMP檢測人工接種蔓枯病菌侵染葉片，以兩種不同基因型蔓枯菌株D. bryoniae（DBJSJY2、DBZJNB7）和無菌水為對照，噴霧接種甜瓜植株。選取前3天無明顯病斑葉片和對照甜瓜葉片提取DNA，用于LAMP檢測侵染葉片的特異性。

結果與分析：（1）通過63 °C恒溫30 min可以檢測包括RG I和RG II在內的所有基因型蔓枯菌株，特異性引物涵蓋蔓枯基因型廣泛，結合鈣黃綠素（calcein）的熒光顯色指示劑作用，建立了目測可視化的蔓枯病菌快速檢測體系。（2）筆者開發的LAMP檢測蔓枯病菌體系，靈敏度為常規PCR反應的1 000倍，檢測下限達到 0.1 fg·μL?1，與之前報道的LAMP方法檢測菌核病菌效率一致。并且比最近報道的檢測蔓枯病菌方法效率高。（3）通過比較檢測葫蘆科作物上其它7種常見病害，我們開發的方法區分特異性高，可以把蔓枯病菌特異性從葫蘆科7種病原（蔓枯病菌、西瓜炭疽病菌、甜瓜鏈格孢葉斑病菌、葫蘆輪枝鐮孢菌、西瓜枯萎病菌0號生理小種、西瓜枯萎病菌1號西瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌2號生理小種）和一種同屬病原（菜豆褐斑病菌）區分開。由于筆者開發的LAMP方法快速、靈敏、可視化、操作簡單，所以對于規模化育苗工廠，苗期早期快速、準確診斷潛病害尤為重要，并且足夠滿足用于潛在侵染作物和大田檢測，所以這一方法對于早期病害診斷和減少病害流行具有重要作用。（4）文獻報道加入環引物（loop primer）后反應速度相比未加環引物的標準法只要1/3～1/2的時間，在30 min內就可以獲得反應結果。筆者的方法檢測速率高與我們設計的引物中加入了環引物（loop primer）有關，但是筆者設計的引物只有loop-backward primer，沒有loop-forward primer，所以筆者最佳反應時間是45 min，還有可以提高的空間。

結? ? 論：本研究開發出一種可視化、快速和廣譜檢測蔓枯病菌的LAMP（環介導等溫擴增）方法，具有簡單，靈敏和特異性的優點。筆者開發的LAMP方法快速、靈敏、可視化、操作簡單，在實際生產中具有多種用途，例如可潛在應用于蔓枯病田間診斷檢測和病害控制，瓜類種子檢疫，以及在育種過程評價瓜類品種對蔓枯病抗性。該診斷工具的前瞻性應用于早期和準確地診斷葫蘆科作物中蔓枯病菌，也可以減少大量殺菌劑的使用，從而有益于保護環境。因此，這項研究代表了開發基于LAMP方法的葫蘆科作物早期病害侵染檢測系統的成功嘗試。