西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的 SSR核心引物構(gòu)建與驗(yàn)證

張海英 王慧 郭紹貴 任毅 宮國(guó)義 翁益群 許勇

目的與意義：西瓜作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和促進(jìn)農(nóng)民致富增收中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)前西瓜生產(chǎn)中種子質(zhì)量問(wèn)題比較突出和普遍，種子純度不夠和假種子坑農(nóng)事件常有發(fā)生，嚴(yán)重干擾了種業(yè)的健康發(fā)展，也是對(duì)品種創(chuàng)新與知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的嚴(yán)重?fù)p害。常規(guī)的品種鑒定難以依靠品種形態(tài)特征進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的品種鑒別。SSR技術(shù)具有共顯性、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但如果將基因組的所有SSR位點(diǎn)對(duì)供試種質(zhì)一一進(jìn)行分析，需要耗費(fèi)大量的人力和物力。針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本研究將依據(jù)西瓜基因組序列開(kāi)發(fā)一套SSR核心標(biāo)記，可用于西瓜種質(zhì)資源核酸指紋庫(kù)構(gòu)建和遺傳背景等研究。

材料與方法：（1）供試材料為北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心的17份重測(cè)序材料和100份遺傳背景清晰的育種材料。（2）SNP數(shù)據(jù)：利用Illumina GAII測(cè)序平臺(tái)對(duì)東亞生態(tài)型西瓜自交系‘97103和其他16份材料進(jìn)行全基因組測(cè)序和重測(cè)序，獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)。（3）西瓜SSR核心引物的開(kāi)發(fā)策略：第一，依據(jù)覆蓋整個(gè)基因組的近390萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)17份重測(cè)序材料繪制SNP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。第二，以栽培種‘97103（東亞生態(tài)類型）和‘Sugarlee（美洲生態(tài)類型）為材料，利用西瓜高密度遺傳圖譜中雙親表現(xiàn)多態(tài)的704對(duì)SSR引物，獲得在2個(gè)栽培種之間中具有多態(tài)性的78對(duì)SSR引物。第三，利用上述78對(duì)SSR引物對(duì)17份重測(cè)序材料進(jìn)行擴(kuò)增。在此基礎(chǔ)上，不斷調(diào)整各種引物組合，最終獲得23對(duì)核心引物組合。引物挑選原則是UPGMA聚類圖與SNP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基本一致;PIC值大于0.45;標(biāo)記數(shù)目最少和每個(gè)連鎖群至少有一個(gè)標(biāo)記;電泳條帶清晰、便于統(tǒng)計(jì)。（4）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：利用Freetree軟件的基于Nei-Li遺傳相似系數(shù)的UPGMA法，計(jì)算17份重測(cè)序材料的遺傳相似性并構(gòu)建UPGMA聚類圖，利用Powermarker v3.0軟件進(jìn)行117份供試材料的UPGMA聚類分析，并采用Dendroscope軟件構(gòu)建聚類圖。

結(jié)果與分析：（1）基于SNP標(biāo)記分析17份重測(cè)序材料的遺傳多樣性：17個(gè)重新測(cè)序材料，共包含3 889 080個(gè)SNP，由于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是通過(guò)比較全基因組序列得到的，因此能正確顯示不同測(cè)序品種的特異性。UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將其分成2大類，與傳統(tǒng)的植物學(xué)分類結(jié)果完全一致。（2）基于78對(duì)SSR引物分析17份重測(cè)序材料的遺傳多樣性：78對(duì)多態(tài)性引物，在17份重測(cè)序材料中共檢測(cè)到285個(gè)等位基因變異，位點(diǎn)多態(tài)性信息含量（PIC）為0.11～0.82，平均0.6。利用78對(duì)多態(tài)性引物構(gòu)建的UPGMA聚類圖與SNP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基本一致，因此，可以將78對(duì)多態(tài)性引物作為備選引物。（3）西瓜SSR核心引物的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證：根據(jù)核心引物開(kāi)發(fā)策略，共獲得23對(duì)核心引物（原表4）。23對(duì)核心引物，在17份重測(cè)序材料中，共檢測(cè)到97個(gè)等位基因，位點(diǎn)多態(tài)性信息含量（PIC）為0.45-0.82，平均0.66。23個(gè)核心引物和78個(gè)備選引物構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖基本相同，而且其遺傳相似系數(shù)矩陣之間的相關(guān)系數(shù)表現(xiàn)為顯著相關(guān)（r=0.96，P<0.005），說(shuō)明23對(duì)核心引物能夠較好地代表遺傳多樣性信息。（4）SSR核心引物有效性驗(yàn)證：利用23對(duì)核心引物，對(duì)100份遺傳背景明晰的育種材料和17份重測(cè)序材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析。UPGMA聚類圖與材料的系譜分析結(jié)果基本一致。而且，23對(duì)核心引物還可以進(jìn)行品種真實(shí)性檢測(cè)，并有效區(qū)分形態(tài)差異很小的材料。比如‘97103和‘98R，雖然形態(tài)和生長(zhǎng)習(xí)性比較近似，但分子檢測(cè)，顯示其有10%的差異。

結(jié)? ? 論： 本研究開(kāi)發(fā)的SSR核心引物，能最大限度地代表遺傳多樣性，很好地完成種質(zhì)資源核酸指紋庫(kù)構(gòu)建、遺傳背景、品種真實(shí)性、純度鑒定等分析工作。