綠色熒光蛋白（GFP）標記的尖孢鐮刀菌 在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖

呂桂云 郭紹貴 張海英 耿麗華 許勇

目的與意義：西瓜枯萎病是由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌寄生引起的一種真菌土傳病害，是世界范圍內導致西瓜產量和品質降低的最嚴重病害。明確枯萎病菌與寄主植物之間的互作機制，揭示其相互作用的分子機制，可為西瓜抗枯萎病育種和病害防治奠定理論基礎。利用綠色熒光蛋白（GFP）作為標記，研究枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖動態，從組織學的角度來闡釋西瓜與枯萎病菌親和互作和非親和互作的差異。

材料與方法：1.以農桿菌AGL1為介導，將帶有潮霉素抗性基因pCH-sGFP質粒轉化到西瓜枯萎病菌中，成功獲得了能穩定持續表達綠色熒光蛋白的枯萎病菌的突變株BEIJING1-sGFP，對轉化子進行抗性鑒定表明，組成型表達sGFP的BEIJING1- sGFP不影響枯萎病菌的致病力。2.以抗病品種‘PI 296341-FR（PI）與感病品種‘Black Diamond （BD）為試驗材料，種子消毒后催芽，采用浸根法接種病菌。3.在接種后的 6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d 、8 d取樣進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

結果與分析：從西瓜枯萎病菌GFP轉化株中選出致病力與轉化前的野生型FON1在西瓜抗、感鑒別寄主上的表現無明顯差異菌株命名為BEIJING1- sGFP，繼代培養后的菌體都有穩定而強的熒光信號，但在細胞質中的液泡無熒光信號。通過人工接種，在無菌條件下進行致病力的檢測，BEIJING1- sGFP與轉化前的野生型FON1在西瓜抗、感鑒別寄主上的表現無明顯差異，說明GFP的轉化和表達對枯萎病菌的轉化株的致病力無明顯影響。

用激光共聚焦顯微鏡觀測GFP標記的西瓜枯萎病菌侵染西瓜感病品種‘Black Diamond過程。在接種6 h后，僅有少量孢子開始萌發（<5%），孢子從一端伸出形成芽管;在1 dpi附著在根系表面的孢子大部分都已經萌發，形成一個長芽管，芽管可向各個方向生長，菌絲在根表生長，隨處可見。試驗觀察發現，菌絲主要出現在根毛區域，菌絲最初黏附在根毛上，然后到達根毛區的根系表面。在接種后2 d，菌絲已經開始侵入了根部的表皮細胞。在滲透位點，呈現為比較重的綠色，菌絲形成類似附著胞的侵染結構，有的菌絲可以形成多個這樣的侵入結構，一些孢子在萌發后，很快就形成附著胞，也有的先在根系表面形成菌絲的網絡結構。

接種后3～4 d，在幾個觀察點上，菌絲主要沿著根系的縱軸伸長，或與根毛松松的交織在一起，到第4天根表已經被相互交織的菌絲稀稀疏疏或稠密的包圍，菌絲已經擴展到了更大的面積，菌絲沿著表皮細胞的凹槽或者在細胞間隙間生長，在細胞周邊形成一個綠色熒光框。在接種后5～6 d，在維管中發現了菌絲生長，在維管周圍皮層細胞中的間隙也有大量的菌絲形成的網狀結構，說明菌絲已經侵入了皮層細胞和維管束。在5 dpi，根系嚴重被感染，根表菌絲已形成網絡結構，僅有根尖部位還保持沒有被感染，菌絲已經到達了中柱螺紋維管處，并沿著木質部生長延伸。接種后第7天到第8天，一些最早定殖的菌絲開始產孢，形成分生孢子，分生孢子繼續萌發，形成再侵染;在根系三級和二級的側根上，菌絲網絡已經緊緊包圍了根系表面的大部分地方，并且侵染的范圍已經擴展到了根尖，在部分小的側根，菌絲完全定殖在根部組織中，并將其原有的結構完全破壞，從顯微觀察看，根表完全被菌絲覆蓋，感染的根系組織已經瓦解，菌絲充滿所有的組織空隙，并包圍根系的表面。

在抗病品種中，在接種后前3 d與感病品種沒有明顯差異，在第4～5天在抗病品種的根系表面形成的菌絲網絡結構沒有感病品種那么密集和明顯，在抗病品種只是形成零星的網絡結構，尤其是在主根上。在抗病品種也只能看到菌絲零星侵入到皮層細胞，抗病品種的侵染相對于感病品種是相對滯后的。菌絲形成的分生孢子沒有大量再萌發的跡象，菌絲也能侵入根尖區域。侵染的程度也相對較輕，抗病品種與感病品種沒有質的區別，只是量的區別和時序上的差異。但在抗病品種中側根中，與感病品種差異不大，根表也形成稠密的菌絲網絡，菌絲能侵入皮層，根系的組織結構也發生瓦解。寄主產生某種物質，規避病原菌侵染主根，或由側根的維管進入主根的維管部位。此外，西瓜抗枯萎病不是抗侵入，而是抗擴張，再次形成的孢子沒有大量萌發的跡象，而在感病品種中，形成的孢子，隨即萌發開始新的世代。

枯萎病菌能從自然開口處（如側生根發生處）和傷口處（如細胞壁破碎的表皮細胞和創傷處）侵染西瓜根系。通過PI染色，發現菌絲。侵入的細胞內有霧狀的紅色，說明此細胞壁已經破碎，染料PI已經滲入表皮細胞。在接種后3 d，菌絲就能通過傷口直接侵入維管組織，并迅速在維管內延伸。菌絲可以在正常的根系表面，通過在侵入位點形成類似附著胞的侵入結構，直接侵入表皮細胞。此結果驗證枯萎病菌是通過自然開口如細胞之間的縫隙、表皮的凹陷部位和次生根毛的基部和傷口進入植物的，但傷口也不是其侵染的必要條件，它也可以直接侵染。

結? ? 論：利用激光共聚焦顯微鏡觀察病原菌在西瓜根系的附著、侵染和定殖等過程。根系表面的孢子在接種當天就開始萌發，菌絲沿著根系表面的縱軸方向伸長，在內部是沿著細胞間隙或細胞間的凹槽生長，菌絲在接種后的第5天就能達到維管束，在侵染后期，產生的分生孢子能再次萌發，形成二次侵染和侵染的繼續擴張，最后菌絲完全充滿根系組織，并伴隨根系組織的瓦解完成其定殖的過程。病原菌在抗、感品種的側根侵染中，基本無差異，但在抗病西瓜品種主根的侵染中與感病品種存在差異，再生的孢子不萌發，侵染過程滯后，侵染程度比較輕，說明西瓜的抗病表現在抗定殖，而不是抗侵入。根系的自然開口和傷口是病原菌優先侵染的位點，但不是枯萎病菌侵染根系所必須的，病菌可以通過形成類似附著胞的侵染結構直接侵入根系表皮的細胞。