高效的西瓜CRISPR/cas9基因敲除技術

田守蔚 姜臨建 高嬙 張潔 宗梅 張海英 任毅 郭紹貴 宮國義 劉凡 許勇

目的與意義：基因編輯技術在植物基因功能鑒定以及重要農藝性狀突變獲得方面具有重要應用價值。CRISPR/Cas9基因編輯技術已應用于許多植物物種，成功實現了靶點突變。然而，目前在西瓜上還沒有CRISPR/Cas9基因編輯技術相關的研究報道，該技術能否成功應用于西瓜研究及育種仍未可知。以西瓜的ClPDS基因（編碼八氫番茄紅素脫氫酶，突變后植株有明顯白化表型）為靶基因，嘗試建立西瓜CRISPR/Cas9基因編輯技術體系，以期利用該技術在西瓜基因組實現精準編輯。

材料與方法：以西瓜自交系‘PI179878為供試材料，利用PEG介導的原生質體轉化方法測試靶點特異性與效率，利用農桿菌介導法轉化西瓜子葉建立西瓜穩定遺傳轉化體系，利用酶切、測序等方法檢測突變效率及突變類型。

結果與分析：（1）靶點選擇與載體構建：選擇西瓜PDS基因ClPDS（Cla010898）作為Cas9核酸內切酶的靶基因。在第1和第3外顯子分別選擇1個靶點，BanI和XhoI酶切位點分別在這2個靶點預測的切割位點上，有利于識別突變。每個靶點的sgRNA分別被克隆到以pGreen為骨架的PHSN401載體中，命名為PHSN1和PHSN2，用于原生質體轉化。2個靶點同時被克隆到pCAMBIA為骨架的PHSE401載體中用于農桿菌介導的西瓜遺傳轉化。（2）CRISPR/Cas9介導西瓜原生質體ClPDS突變：利用PEG介導的原生質體轉染檢測靶點的效率，采用PCR/限制性內切酶（PCR/RE）試驗檢測靶位點的突變并估計突變率。PHSN1或PHSN2分別轉染到西瓜原生質體細胞中，打靶效率分別為51.6和42.1%。結果表明，構建的CRISPR/Cas9載體可在西瓜細胞中瞬時表達，Cas9/sgRNA復合體可以高效地對這2個靶點進行打靶。（3）CRISPR/Cas9介導西瓜植株ClPDS突變：對西瓜進行農桿菌介導的遺傳轉化，共獲得16株轉基因植株，這些植株均表現出純的或嵌合的白化表型。限制性內切酶消化PCR產物表明，這2個靶點在16株轉基因株系中均發生編輯。隨機選擇純白化株系10、株系14和嵌合白化株系3進行PCR和Sanger測序。對于靶點1，株系3是雜合的，株系10和14為嵌合體。對于靶點2，株系3和株系10為單等位基因純合，分別有7 bp的缺失和1個bp的插入。株系14是雜合體，一個等位基因缺失17bp，另一個等位基因缺失5bp（原圖3）。（4）潛在脫靶性分析：PCR產物測序結果表明，與目的靶點序列相似的潛在靶點未發生突變，說明sgRNAs介導的CRISPR/Cas9編輯系統對西瓜ClPDS基因的定向突變具有高的特異性。

結? ? 論：CRISPR/Cas9基因編輯系統可以通過瞬時轉化或穩定遺傳轉化進行西瓜基因的定點編輯，所獲T0陽性植株含有ClPDS突變并表現出明顯白化表型，表明CRISPR/Cas9系統在轉化株系中具有高的基因編輯效率。CRISPR/Cas9基因編輯系統在單個轉化事件中可以實現多個靶點的高效打靶，并在T0代即有可能獲得純合突變株。CRISPR/Cas9基因編輯系統將成為西瓜基因功能研究和遺傳改良的有利工具。