利用CRISPR/Cas9介導的單堿基編輯 技術創制抗除草劑西瓜新種質

田守蔚 姜臨建 崔霞霞 張潔 郭紹貴 李茂營 張海英 任毅 宮國義 宗梅 劉凡 陳其軍 許勇

目的與意義：草害嚴重威脅了西瓜的產量與品質，然而在中國注冊的西瓜除草劑只有5種，且對闊葉雜草控制效果較差，因此急需有效的瓜田雜草控制方案。培育抗除草劑西瓜新品種是解決西瓜田間草害的有力措施，但依靠傳統的育種手段幾乎無法實現。因此，筆者希望利用CRISPR/Cas9單堿基編輯技術對西瓜ALS基因（編碼乙酰乳酸合成酶，植物支鏈氨基酸生物合成關鍵酶）190位的脯氨酸位點進行編輯，獲得具有抗ALS類除草劑的西瓜新種質，為西瓜田闊葉雜草的控制提供有效的技術方案。

材料與方法： 將包含西瓜ALS基因190位點的gRNA構建至CRISPR/Cas9單堿基編輯載體pBSE901中，其中BE3（第三代單堿基編輯器）由2個35S啟動子啟動（原圖1-b），可以在西瓜基因組靶點處3～9 bp的位置實現C堿基的改變（原圖1-a）。將構建好的載體轉化農桿菌EHA105菌株以農桿菌介導的轉化方法轉化至西瓜ZG94的子葉。陽性再生植株通過膠體金免疫分析試紙及Sanger測序鑒定。

結果與分析：（1）單堿基編輯效率達23%：T0代共獲得199株陽性株，測序結果表明，有45株發生C至T突變，表明單堿基編輯效率高達23%。其中有34株僅在第7位發生C至T轉換，另外11株植株在位置7和8均發生了C至T的轉換（原圖1-c）。（2）編輯位點穩定遺傳：對T0代的株系1、4及6的T1代基因型進行分析，結果顯示，后代分離過程中再次編輯的發生在很大程度上使等位基因分離復雜化，但結果清楚地表明點突變可以高效的遺傳給下一代。（3）T1獲得不含轉基因成分的抗性株：通過PCR、膠體金免疫分析試紙測試及草銨膦處理等多種檢測手段，來自株系1、4、6 T1代的7/24、6/20和4/19植株含有堿基編輯的等位基因但沒有BE3基因，這些植株在構建的T-DNA區域不含bar基因翻譯的PAT蛋白，證明T1代即可獲得不含轉基因成分的P190S單堿基編輯純合株。（4）P190S除草劑抗性水平及生長水平評估：單堿基編輯獲得的P190S純合植株與野生型對照同時用苯磺隆（針對闊葉雜草控制非常有效的ALS類除草劑）處理。1 hm2 17 g苯磺隆（ai）處理后14 d，所有野生型植株都嚴重受損，P190S植株不受影響（原圖1-e），1 hm2 68 g處理純合P190S植株時發生輕微損傷，但在處理后30 d內恢復正常生長。P190S純合株的果實、種子大小及種子產量與野生對照沒有差異。

結? ? 論：成功建立了西瓜高效單堿基編輯體系，創制了不含轉基因成分的抗除草劑西瓜新種質。這些無轉基因成分的堿基編輯抗除草劑西瓜植株在遺傳學上與傳統誘變育種相同，且單堿基編輯點突變對西瓜正常生長無不良影響，因此這種抗除草劑西瓜新種質可以進行田間應用。本研究結果表明，CRISPR/Cas9介導的單堿基編輯系統是改良西瓜種質的強大工具。