西瓜液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是西瓜含糖量QTL區(qū)間的主效基因

任毅 郭紹貴 張潔 何洪巨 孫宏賀 田守蔚 宮國義 張海英 許勇

目的與意義： 西瓜（Citrullus lanatus）果實(shí)中的可溶性糖積累是西瓜長期馴化過程中主要品質(zhì)性狀之一。目前，關(guān)于西瓜中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是如何調(diào)節(jié)果實(shí)中各種糖積累的這一機(jī)制尚不清楚，特別是像西瓜這種儲(chǔ)存高濃度蔗糖的作物。筆者旨在縮小已報(bào)道的糖含量QTL的區(qū)間，以及構(gòu)建超高密度SNP遺傳圖譜來確定QBRX2-1 QTL的決定基因，并闡明西瓜馴化過程中糖分積累的分子機(jī)制。

材料與方法：對高糖西瓜栽培品種‘97103（Citrullus lanatus var. lanatus）和低糖西瓜野生品種‘PI296341-FR（C. lanatus var. citroides）雜交后產(chǎn)生的96株系RIL群體進(jìn)行了重測序，并構(gòu)建超高密度SNP連鎖圖譜精細(xì)定位含糖量QTL。結(jié)合不同的生化和遺傳方法，驗(yàn)證結(jié)果并得出結(jié)論。

結(jié)果與分析： 連續(xù)3年鑒定96株系RIL群體的Brix（可溶性固形物），F(xiàn)ru（果糖），Glc（葡萄糖）和Suc（蔗糖）含量并做了表型分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，除Suc外，其他幾種糖含量性狀的遺傳力（h2）相對較高（>85%）。含糖量QTL精細(xì)定位結(jié)果證明，Cla000264為QBRX2-1糖含量QTL的決定基因，Cla000264與擬南芥液泡膜單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtTST2具有約78%的氨基酸一致性和88%的序列相似性。因此，將這種西瓜基因命名為C. lanatus tonoplast sugar transporter 2（ClTST2）。

在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中確定了3個(gè)ClTST直系同源物，比較高糖栽培品種‘97103和低糖野生品種‘PI296341-FR的不同組織中ClTSTs的表達(dá)，證實(shí)ClTST2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與Suc積累正相關(guān)。相反，ClTST1和ClTST3在西瓜果實(shí)糖積累期間表達(dá)較低。對96株系RIL群體成熟果實(shí)和核心種質(zhì)中進(jìn)行了qRT-PCR，證實(shí)了ClTST2轉(zhuǎn)錄與西瓜果肉中糖含量呈正相關(guān)。ClTST2 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中果肉糖含量明顯增加，表明較高的ClTST2表達(dá)水平是增加西瓜果肉糖積累所必需的。

將高糖栽培品種97103-ClTST2序列與黃色熒光蛋白（YFP）基因融合并轉(zhuǎn)化西瓜果實(shí)原生質(zhì)體，證實(shí)西瓜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ClTST2的液泡膜定位。將97103-ClTST2與GFP基因融合，并在人胚腎細(xì)胞293T（HEK293T）細(xì)胞中瞬時(shí)過表達(dá)融合基因，在HEK293T細(xì)胞的質(zhì)膜中觀察到融合蛋白的綠色熒光，發(fā)現(xiàn)了 HEK293T細(xì)胞中ClTST2的細(xì)胞膜定位。通過膜片鉗技術(shù)在HEK293T表達(dá)栽培種‘97103 ClTST2基因，通過電流變化驗(yàn)證了ClTST2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。當(dāng)把50 mmol·L-1 Suc置于HEK293T細(xì)胞膜的外部時(shí)，攜帶ClTST2的細(xì)胞相對于負(fù)對照電流的響應(yīng)，將50 mmol·L-1 Fru和Glc置于HEK293T細(xì)胞膜的外部時(shí)表現(xiàn)出相同的結(jié)果，而在不存在ClTST2的情況下，HEK293T細(xì)胞未顯示出明顯的電信號(hào)。為了證實(shí)這一結(jié)果，在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中進(jìn)行了放射性標(biāo)記的糖外排試驗(yàn)。試驗(yàn)中，瞬時(shí)過表達(dá)非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的ClTST2-GFP，再次確認(rèn)ClTST2的質(zhì)膜定位，把被[14C]標(biāo)記的糖注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，[14C]標(biāo)記的糖隨著時(shí)間變化而外排，ClTST2蛋白在pH 6.5下表現(xiàn)出對Suc、Fru和Glc的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

雜交高糖栽培品種‘97103和低糖的‘G35 RIL產(chǎn)生的西瓜近等基因系（NILs），它與栽培種‘97103具有很高的遺傳同一性和表型相似性。BC2的親本F1植物（97103×G35）回交‘97103，BC2F1自花授粉產(chǎn)生BC2F2群體，此舉可以分析ClTST2等位基因變異對同一西瓜果實(shí)類型中果實(shí)糖積累的影響。通過qRT-PCR分析親本和后代的成熟果實(shí)的可溶性固形物含量和ClTST2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明ClTST2表達(dá)與西瓜果肉中糖積累呈正相關(guān)。同樣在栽培草莓（F. ×ananassa）中瞬時(shí)表達(dá)該基因，從而間接驗(yàn)證了在西瓜RIL群體中ClTST2在西瓜中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，所以，較高的糖濃度可加速西瓜果實(shí)向成熟過渡。

目前還沒有任何報(bào)告關(guān)于植物中特定轉(zhuǎn)錄因子對TST基因的調(diào)節(jié)。為了在功能上確定主要的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域，將ClTST2啟動(dòng)子區(qū)域5端的不同長度的DNA片段與熒光素酶（LUC）基因融合，并在草莓果實(shí)和煙草葉中瞬時(shí)表達(dá)，調(diào)節(jié)ClTST2表達(dá)的DNA序列元件可能位于-1 000和-1 500 bp之間。結(jié)果表明，在高糖西瓜中A/C顛換SNP（-1 368）改變了W box3，其可以作為WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，其調(diào)節(jié)ClTST2表達(dá)并且在糖積累中起關(guān)鍵作用。

ClTST2位于QTL區(qū)間的40 kb馴化區(qū)域，ClTST2啟動(dòng)子區(qū)域的W box3中的-1 368個(gè)SNP（A/C）解釋了124個(gè)種質(zhì)中的大部分糖含量變化。結(jié)果表明，西瓜中果實(shí)糖積累需要ClTST2活性。此外，該結(jié)果揭示了在西瓜馴化過程中更高的ClTST2表達(dá)被選擇出來，導(dǎo)致西瓜中糖的積累增加。分析表明，果實(shí)發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞代謝基因、囊泡介導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在選擇過程中表現(xiàn)出富集狀態(tài)。該結(jié)果表明，在馴化期間ClTST2被選擇，促進(jìn)西瓜果實(shí)中的糖積累。

結(jié)? ? 論：研究結(jié)果表明，ClTST2是一種定位于西瓜糖含量QTL區(qū)域的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，它編碼一個(gè)液泡定位的Suc、Fru和Glc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。與對照相比，ClTST2的過表達(dá)導(dǎo)致糖含量顯著增加。由SUSIWM1上調(diào)的ClTST2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與果實(shí)成熟期間的糖積累顯著正相關(guān)。由此得出結(jié)論，ClTST2是調(diào)控西瓜果實(shí)細(xì)胞液泡中Suc、Fru和Glc積累的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。