氣管瘢痕狹窄動物模型的建立和病理學研究

湯蘇成 王躍建 朱肇峰*

（佛山市第一人民咽喉頭頸外科，廣東 佛山 528000）

長期以來，氣管瘢痕性狹窄是耳鼻咽喉－頭頸外科工作常遇到的一大難題。要在氣管瘢痕狹窄的治療上取得突破，就必須了解氣管瘢痕的發(fā)生機制及影響因素。由于缺少穩(wěn)定的動物模型，很多對瘢痕的研究成果均來源于皮膚瘢痕[1-2]。我們擬建立了犬氣管狹窄的動物模型，研究氣管瘢痕狹窄的形成過程和病理學特點，為下一步的研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 材料與設備：成年比格犬6只，購自廣東省實驗動物中心。體質(zhì)量在30～40 kg。實驗及動物飼養(yǎng)場所由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。HE染色試劑由佛山市第一人民醫(yī)院病理科提供。纖維連接蛋白（Fn）兔抗人多克隆抗體、MaxvisionTM免疫組化試劑盒，購至福州邁新生物科技有限公司。苦味酸－天狼猩紅溶液，購至北京海德生物有限公司。CM10型透射電鏡：由中山大學電子顯微鏡室提供使用。E600POL偏光顯微鏡：由中科院廣州地球化學研究所提供使用。

1.2 動物模型：實驗動物鹽酸氯胺酮200mg肌肉注射誘導麻醉后，從前肢靜脈持續(xù)靜滴0.1%氯胺酮葡萄糖鹽溶液維持麻醉。在氣管下段行氣管切開并永久皮膚造瘺。取頸前縱切口，暴露氣管。切開氣管前壁正中，切口長3 cm。拉開氣管前壁小心刮除此段氣管前1/2內(nèi)壁黏膜到軟骨膜，3-0可吸收線縫合氣管前壁，再逐層關閉術腔。分別術后1周、2周、1個月、2個月、4個月、6個月行支氣管鏡檢查；同時取瘢痕處病例標本進行病理學檢查。6個月時處死動物取全層氣管標本進行觀察。

表1 CD3 T淋巴細胞、CD68巨噬細胞計數(shù)的半定量分析（個/4.48×104μm2）

表2 纖維連接蛋白和Ⅰ＋Ⅲ型膠原含量的半定量分析（目標面積×104 μm2/2.24×104μm2）

1.3 大體標本及常規(guī)HE染色。

1.4 免疫組化（MaxvisionTM法）：行CD3T淋巴細胞，CD68巨噬細胞和纖維連接蛋白（Fn）免疫組化染色。

1.5 膠原纖維的分析：行Ⅰ、Ⅲ型膠原苦味酸－天狼猩紅染色。暗視野條件下用偏振光顯微鏡下觀察。顯微鏡下觀察。每張切片隨機于固有層取4幅視野，于400倍鏡下采用全自動圖像分析對T細胞，巨噬細胞數(shù)半定量分析，統(tǒng)計場總面積分別為4.48×104μm2。于200倍顯微鏡下分析纖維連接蛋白（Fn）和I、III型膠原纖維的目標面積。統(tǒng)計場總面積為2.24×104μm2。

1.6 透射電鏡觀察：每個觀察點均取1 mm×1 mm×3 mm新鮮氣管瘢痕組織經(jīng)超薄切片后，透射電鏡（CM10型）下觀察。

2 結 果

2.1 術后情況：實驗動物術后一般情況好，所有實驗動物全部存活到預定時間。大體及HE染色觀察，術后1周可見肉芽組織開始增生突向管腔；在術后2個月時肉芽組織增生達到高峰，管腔進一步狹窄狹窄，術后4個月及6個月氣管瘢痕基本穩(wěn)定，氣管中重度攣縮，有瘢痕樣色素沉著。鏡下氣管創(chuàng)面為復層鱗狀上皮細胞，固有層肥厚紊亂，仍可見成纖維細胞。

2.2 慢性炎性細胞：術后1周開始固有層中可見大量T細胞、巨噬細胞浸潤，分布廣、密度高。細胞體積大，時間持續(xù)至術后4個月，之后開始較少。見表1。

2.3 細胞外基質(zhì)：纖維連接蛋白（Fn）免疫組化顯示成纖維胞胞質(zhì)、胞膜可見大量網(wǎng)格分布的陽性信號。持續(xù)存在至術后6個月。偏振光顯微鏡下，固有層中波紋狀長、紅色的Ⅰ型膠原明顯增多，排列紊亂，呈漩渦狀、團塊狀。黃綠色、細纖維的Ⅲ型膠原量少，排列紊亂。見表2。

2.4 透射電鏡：術后1個月開始氣管黏膜開始為鱗狀上皮覆蓋，至4個月時完全覆蓋。固有層中可見大量粗的，厚度不同、方向混亂的膠原纖維，膠原絲中胞質(zhì)內(nèi)絲和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)槽的胞質(zhì)明星突起。術后1～6個月均可見成纖維細胞，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，游離核糖體豐富，核大、核仁亦大，常染色質(zhì)豐富。

3 討 論

隨著兔耳瘢痕模型的建立，皮膚瘢痕的研究進入了一個新的階段，瘢痕形成的機制也研究到細胞分子、基因調(diào)控水平[3]。而由于缺少穩(wěn)定的實驗模型，對氣管瘢痕的研究更是還處于起步階段，因此，我們希望能建立穩(wěn)定的氣管瘢痕狹窄的動物模型，研究氣管瘢痕的特點和形成過程，并為下一階段的研究奠定基礎。本實驗刮除犬氣管前1/2的黏膜，創(chuàng)面裸露后，術后大體及病理觀察明確瘢痕形成。我們認為，是一種可行的氣管瘢痕狹窄模型建立方法。

我們的病理學觀察發(fā)現(xiàn)，氣管瘢痕與慢性炎性細胞浸潤、細胞外基質(zhì)成分改變及排列紊亂、成纖維細胞持續(xù)功能亢進關系密切。

我們發(fā)現(xiàn)，本實驗中，從術后1周開始，CD3T淋巴細胞、CD68巨噬細胞異常增高并持續(xù)浸潤。局部炎性細胞可通過釋放細胞因子，激活巨噬細胞釋放介質(zhì)，從而誘導成纖維細胞的增生和膠原的合成，導致膠原的大量沉積和無序排列[4]。

Fn是一組與創(chuàng)傷修復關系最密切的結構性糖蛋白，是細胞外基質(zhì)重要成分。如果Fn持續(xù)高水平表達，可致使成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的凋亡速度減慢或中斷，成纖維細胞相對過剩，導致增生性瘢痕形成[5-6]。我們發(fā)現(xiàn)，氣管瘢痕組織中，纖維連接蛋白（Fn）在黏膜固有層持續(xù)高表達至術后6月，因此，我們推斷，F(xiàn)n在氣管瘢痕形成中同樣發(fā)揮的巨大作用。

成纖維細胞在皮膚瘢痕形成中有著關鍵性的作用。成纖維細胞是合成細胞外基質(zhì)主要細胞，具有很強的分泌膠原的能力，還能分泌一系列的細胞因子介導瘢痕的形成[7-8]。正常創(chuàng)傷愈合后期，成纖維細胞凋亡，最終消失，瘢痕亦停止生長。如果成纖維細胞不能進入凋亡途徑，就會導致增生性瘢痕的產(chǎn)生[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，氣管瘢痕形成過程中，成纖維細胞明顯增多，電鏡下細胞處于高分化狀態(tài)，同樣具有關鍵作用。本實驗成功建立了氣管瘢痕狹窄的動物模型，并對瘢痕形成的機制進行了初步探討。我們發(fā)現(xiàn)，氣管瘢痕形成與上皮細胞缺損、慢性炎性細胞浸潤、細胞外基質(zhì)紊亂和成纖維細胞生物活性關系密切，這為我們下一步的更深層機制和治療策略的研究提供了方向。