堿熱處理結合生物化修飾促進鈦表面快速內皮化的研究

吳興達 曾 琳 呂群松*

（1 廣東醫科大學信息工程學院，廣東 東莞 523808；2 廣東醫科大學藥學院，廣東 東莞 523808）

經皮冠狀動脈血管支架植入是目前治療冠心病的一種重要手段，臨床上廣泛使用的藥物洗脫支架會抑制血管內皮細胞增殖，導致血管內皮細胞層修復延遲，容易發生支架植入后再狹窄的風險[1]。支架表面的快速內皮化可減少血小板的激活及血栓形成，形成生物相容性良好的界面，降低遠期血栓的風險。本文比較HUVECs在三種不同鈦表面的活性和增殖行為，探討促進支架材料表面快速內皮化的方法。

1 材料與方法

1.1 載槲皮素殼聚糖納米粒的制備：采用離子交聯法，首先配置2 mg/mL的殼聚糖醋酸溶液，磁力攪拌下逐滴滴入槲皮素的乙醇溶液，使槲皮素與殼聚糖的質量比為1∶20，再逐滴滴入三聚磷酸鈉溶液，連續攪拌得到淡黃色的膠體溶液。使用Microtrac粒度分析儀分析納米粒大小及Zeta電位。

1.2 三種鈦表面的制備及表征：依次用800、1200、1500、2000目砂紙及拋光布將商業鈦片拋光至鏡面狀態，再分別用丙酮、無水乙醇和蒸餾水超聲清洗，獲得光滑表面鈦片。將光滑鈦片在80 ℃的5 mol/L NaOH溶液中浸泡24 h，再置于80 ℃的蒸餾水中浸泡12 h，最后蒸餾水超聲清洗，獲堿熱處理鈦片。堿熱處理鈦片浸泡在載槲皮素殼聚糖膠體中，10 h后取出，用蒸餾水漂洗去表層未吸附的納米粒，獲得生物化修飾鈦片。三種鈦片干燥噴金后用掃描電子顯微鏡觀察表面形貌。

1.3 HUVECs的培養：HUVECs（購于中國科學院細胞庫）培養于含5%胎牛血清，1%內皮細胞生長因子（ECGS）和1%青霉素/鏈霉素的ECM培養液中。采用培養瓶常規培養，以0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.4 HUVECs活性及增殖能力檢測：三種鈦片置于12孔板內，HUVECs按2×104cells/孔接種于鈦片上，分別孵育24 h和48 h。吸取培養液，加入Calcein-AM （Invitrogen）和碘化丙啶（PI, Sigma-Aldrich）混合液1 mL/孔浸泡樣品，37 ℃避光孵育20 min后，用PBS洗去多余染料。4%多聚甲醛固定，熒光顯微鏡觀察、拍照。

2 結 果

2.1 載槲皮素殼聚糖溶液的檢測：紅色激光筆照射載槲皮素殼聚糖溶液可見明顯的丁達爾效應，粒徑分析表明絕大部分納米粒粒徑介于100～300 nm，Zeta電位為50.4 mV。見圖1。圖1顯示，紅色光束穿過殼聚糖溶液，未見丁達爾效應，表明殼聚糖的醋酸溶液是真溶液；紅色光束穿過槲皮素/殼聚糖溶液，側面可見溶液內部可見光束“通路”，丁達爾效應顯著，表明該溶液是膠體；槲皮素難溶于水，經攪拌，其在水中形成渾濁液，光束無法穿透。

2.2 掃描電鏡觀察鈦片結果：拋光后的鈦片表面平整，堿熱處理后的鈦片表面均勻分布大量亞微米量級大小的孔洞，吸附載槲皮素殼聚糖納米粒后孔洞結構被覆蓋，顯得相對平滑。見圖2、3。

2.3 細胞活性和增殖情況：熒光顯微鏡觀察表明三種鈦片表面均未見紅色的死亡細胞，所有細胞均呈綠色，表明三種鈦片都具有良好的細胞相容性。細胞增殖方面，孵育24 h后，光滑鈦片表面細胞較少，堿熱處理鈦片表面細胞稍多，而生物化修飾鈦片的細胞明顯多于光滑鈦片細胞；孵育48 h后，三種鈦片表面細胞密度差異明顯增大，尤其是生物化修飾鈦片表面的細胞遠遠多于光滑表面的細胞（圖4）。

3 討 論

鈦及其合金密度小、機械性能好、化學性能穩定，是一種廣泛使用的生物材料，然而并不適用于與血液直接接觸的應用場景[2]。在人工血管、血管支架等血液接觸材料的設計中，抗凝血和內皮化是必須解決的兩大問題，其中實現材料表面的快速內皮化可降低血栓發生率。殼聚糖是天然多糖甲殼素脫乙酰化而得到的一種堿性氨基多糖，其結構與細胞外基質中的糖胺多糖相似，因此具有極為優良的生物相容性和生物學活性，被廣泛應用于生物醫學領域[3]。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，廣泛存在于植物中，是多種中藥的主要成分，能抑制過氧化氫（金屬表面在體液內被腐蝕的產物）對內皮細胞的損傷[4]。

圖1 激光筆照射三種液體的檢測結果

圖2 槲皮素-殼聚糖納米粒的粒徑分布

圖3 掃描電鏡觀察鈦片結果

圖4 細胞在三種鈦片表面分別孵育結果

本文通過堿熱處理在鈦表面腐蝕出大量均勻分布的亞微米級孔洞，細胞增殖實驗表明粗糙表面比光滑表面更有利于內皮細胞增殖，這與成骨細胞的情況類似[5]。同時堿熱處理增加了鈦表面的羥基數量，使表面帶負電荷，這是靜電吸附載槲皮素殼聚糖納米粒的基礎。而大量亞微米級孔洞也增大了鈦材吸附殼聚糖納米粒的面積，因而增加了載藥量。實驗結果表明，表面粗糙結構及生物化修飾均有利于內皮細胞增殖，而二者相結合，可極大地促進材料表面的快速內皮化。因此本研究為降低支架內再狹窄率，優化血管支架的遠期療效提供了方法上的參考。