麥冬根部一種真菌性病原鑒定及其生物學特性研究

蔣欣東，任夢星，王福楷，蔣 秀，康曉慧，張 洪

(西南科技大學 生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010)

麥冬(Ophiopogonjaponicus)是多年生常綠草本植物，藥用麥冬有山麥冬屬和沿階草屬[1]，是中醫(yī)治病處方中不可缺少的常用中藥材，麥冬的主要藥用部分為塊根。麥冬的野生資源分布較廣[2]，市場需求量較大，因此人工種植面積不斷擴大。藥用麥冬栽培范圍廣，主產(chǎn)區(qū)為浙江省的慈溪、蕭山，四川省的綿陽三臺，湖北的襄樊、襄陽等省區(qū)[3-4]。麥冬是四川綿陽應(yīng)用廣泛的一種道地中藥材，為中成藥和保健食品的重要原料，也是理想的綠化植物，為出口創(chuàng)匯的農(nóng)產(chǎn)品之一，經(jīng)濟效益較好，市場需求逐年增加。目前對麥冬藥用成分的研究較多，但對其病害的研究較少，特別是對其根部病害的研究更少。因此，筆者等對麥冬根部病害進行深入研究，為麥冬病害防治和規(guī)模化種植提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

麥冬品種為川麥冬，病害植株采自綿陽三臺花園鎮(zhèn)，該地區(qū)農(nóng)戶都種植有大量的川麥冬。

1.2 病害植株癥狀觀察

觀察病害植株整體的生長情況，葉片顏色，植株萎焉情況，病斑大小，顏色，性狀及特殊癥狀[5]。

1.3 病原菌的分離與純化

病原菌通過組織分離法分離，在PDA中培養(yǎng)，病組織周圍生長菌落后，在無菌條件下使用滅菌牙簽挑取少量菌絲到新的PDA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)進行純化。純化后病菌在5℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌的鑒定

取少量菌絲，用蒸餾水作浮載劑制成臨時玻片，然后放于光學顯微鏡下觀察、拍照并記錄菌絲和孢子的形態(tài)特征[6]，根據(jù)菌絲和孢子形態(tài)特征結(jié)合查閱資料對病原菌進行形態(tài)鑒定。

1.5 病原菌生物學特性測定

根據(jù)前期麥冬分離純化后的病原菌，利用生物學特性研究方法，在不同溫度(5～35℃)、光照(24 h黑暗，24 h光照，24 h黑暗/24 h光照)、pH(4～12)、碳源(木糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉、蔗糖)、氮源(硝酸鈉、甘氨酸、L-胱氨酸、氯化銨、磷酸二氫銨)等條件下培養(yǎng)并測定生物學特性。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，PowerPoint 2010進行圖片處理，利用SPSS 21.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病株癥狀

麥冬病株葉部發(fā)黃，田間植株長勢不良的，挖出發(fā)現(xiàn)塊根頂部為紅褐色，部分塊根和須根中部也有少許紅褐色，由病斑處開始，有變軟的跡象。

2.2 病原菌的分離鑒定

PDA上分離純化出1種真菌性病菌；在LB培養(yǎng)基上沒有菌株生長，表明分離的麥冬塊根上沒有細菌性病害。

病原菌在28℃黑暗條件下培養(yǎng)2天，培養(yǎng)基中開始出現(xiàn)白色菌絲體，繼續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)淡紫色菌絲。4～5 d后菌絲中央呈凸起狀，菌落邊緣為絲狀，比較稀疏，呈放射狀向外延伸(圖1)；病原菌菌絲為有隔垂直分枝，有鐮刀狀大型分生孢子和小型分生孢子(圖2)。病原菌形態(tài)特征與鐮刀菌屬描述相似，鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)[7-13]，麥冬病害為根腐病。

圖1 病原菌在培養(yǎng)基中的形態(tài)

Fig.1 Morphology of pathogens in culture medium

注：A為菌絲垂直分枝，B為小型分生孢子和大型分生孢子。

Fig.2 Mycelial morphology of pathogens

2.3 病原菌的生物學特性

2.3.1 生長溫度 從圖3看出，在溫度梯度為5～35℃時，菌株在5℃、10℃下幾乎不生長；20～30℃時菌絲生長較好，菌絲直徑較大，平均生長速率較高(0.95 cm/d、1.00 cm/d和1.02 cm/d)，差異不顯著；35℃時生長速率明顯下降。說明，該菌株的最佳生長溫度為25～30℃，不適宜在高溫和低溫下生長。

2.3.2 光照 從圖4看出，菌絲直徑隨著培養(yǎng)時間的增加而增加。菌株在不同光照條件下生長速率差異不顯著，12 h黑暗12 h光照條件下菌株生長速率稍高，24 h光照的最低。推測該菌株對光照條件不敏感。

2.3.3 pH 從圖5看出，病原菌菌株在pH為4～12范圍均能生長，生長速率隨pH的升高呈上升趨勢，pH為10時生長情況最好。酸性條件pH 4、pH 6與堿性條件pH 8、pH 10、pH 12間差異顯著(P<0.05)。說明，該菌株在pH 4～12范圍均能生長，在偏堿性環(huán)境下生長更好一點。

2.3.4 碳源 從圖6看出，28℃和黑暗條件下，菌株在供試糖源培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天均能生長，供試的6種糖源生長速率無明顯差異，以蔗糖為糖源的生長速率稍高，其次是木糖，葡萄糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基上菌株生長速率稍差。以蔗糖與葡萄糖為糖源的菌絲生長速率間差異顯著(P<0.05)，其他碳源間差異不顯著。

圖3 不同溫度下菌絲直徑和平均生長速率

Fig.3 Mycelial diameter and average growth rate at different temperatures

圖4 不同光照下菌絲生長直徑和平均生長速率

Fig.4 Mycelial growth diameter and average growth rate under different illumination

圖5 不同pH下菌絲生長直徑和平均生長速率

Fig.5 Mycelial growth diameter and average growth rate at different pH

2.3.5 氮源 從圖7看出，菌株在28℃、黑暗條件下，供試氮源培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d均能生長，但5種氮源間菌絲生長存在差異。其中，菌株在硝酸鈉、甘氨酸、L-胱氨酸3種氮源培養(yǎng)基上生長速率較快，約為0.9 cm/d，各處理間差異不明顯；在氮源NH4Cl、NH4H2PO4上生長較為緩慢，生長速率約為0.45 cm/d，且與其他3種氮源存在顯著差異。

圖6 不同碳源下菌絲生長直徑和平均生長速率

Fig.6 Mycelial growth diameter and average growth rate under different carbon sources

圖7 不同氮源下菌絲生長直徑和平均生長速率

Fig.7 Mycelial growth diameter and average growth rate under different nitrogen sources

3 結(jié)論與討論

研究的麥冬根部尖孢鐮刀菌的生物學特性其碳源生長情況與詹洪[14]、鄭肖蘭等[15]的研究結(jié)果相似；菌絲最適生長溫度為25～30℃，與詹洪[14]、鄭肖蘭[15]、楊輝輝[16]等的研究結(jié)果相似；菌絲適宜中性至堿性條件生長，與鄭肖蘭[15]的研究結(jié)果相似；最適在12 h黑暗12 h光照下生長，與鄭肖蘭[15]的研究結(jié)果有微小差異。麥冬根部尖孢鐮刀菌菌絲在不同氮源下的生長速率為硝酸鈉>L-胱氨酸>甘氨酸>磷酸二氫銨>氯化銨，與楊輝輝等[16]研究的生長速率氯化銨>硝酸鈉>甘氨酸>L-胱氨酸>磷酸二氫銨差異較大。原因可能是由于尖孢鐮刀菌存在許多的專化形，不同的專化形之間其生物學特性以及致病性存在差異。分離鑒定的尖孢鐮刀菌是否為麥冬專化型有待進一步研究。

對病原菌的生物學特性鑒定有助于了解其發(fā)生規(guī)律，為麥冬病害防治和規(guī)模化種植提供理論基礎(chǔ)。麥冬根部病害分離得到的菌株為尖孢鐮刀菌，與前人研究的麥冬根腐病病原菌一致，但前人研究中并未對麥冬根腐病病原菌鑒定進行詳細報道，也沒有對病原菌的生物學特性進行研究。尖孢鐮刀菌是一種常見的病菌，在油菜、花生、黃瓜、芝麻等植物中均能找到該病原菌。尖孢鐮刀菌既可侵染植物又可在土壤內(nèi)生存的兼性寄生真菌，因此，麥冬與其他作物輪作時是否會被其留下的尖孢鐮刀菌侵染，還有待進一步試驗證實。