工廠化生產海鮮菇菌包污染細菌的分離鑒定及防治

趙瑞華， 賀曉龍， 劉月芹， 孫常青

(1.延安大學 生命科學學院， 陜西 延安 716000； 2.陜西省紅棗重點實驗室， 陜西 延安 716000； 3.陜西瑞福興生物科技有限公司， 陜西 渭南 714000)

海鮮菇〔Hypsizygusmarmoreus(Peck) H. E. Bigelow〕又名玉蕈和蟹味菇，屬擔子菌門層菌綱傘菌目白蘑科玉蕈屬，形態美觀，味道鮮美獨特，質地脆嫩，常被稱為“假松茸”[1-2]，是一種高蛋白、低脂肪、富含多種礦物質和維生素的保健食品，具有平衡膳食，提高免疫力，延年益壽的功效[3-9]。海鮮菇是我國重要的食藥用真菌資源，深受消費者喜愛，產量正逐年提高。但由于生產周期較長，生長速度較慢，抑制雜菌的能力較差，尤其在工廠化生產的任何時期均可能發生雜菌(細菌和霉菌)污染，特別是菌絲生長階段最易受雜菌污染，因此嚴重影響海鮮菇的產量與品質，造成巨大經濟損失的同時嚴重影響和阻礙海鮮菇產業的發展[10-17]。加之培養基營養水分充足，如果滅菌不徹底更有利于細菌的生長增殖[18]。食用菌被細菌感染后仍然可以生長，但由于營養物質的流失導致生長緩慢，嚴重時可導致培養基腐敗、有酸臭味，徹底無法生長從而致使栽種失敗[19-20]。目前，食用菌栽培污染研究大多是關于霉菌方面的報道，關于海鮮菇工廠化生產污染細菌的研究鮮見報道[21]。鑒于此，筆者對海鮮菇工廠化生產菌包常見細菌病害進行調查，分離純化病原菌株，采用傳統形態學和現代分子生物學手段對污染細菌進行鑒定，并在此基礎上探討常用抑菌藥劑對細菌的防治作用，以期為海鮮菇工廠化生產細菌病害的綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 海鮮菇菌包 海鮮菇菌包由陜西瑞福興生物科技有限公司提供，隨機采集污染菌包，4 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 培養基 培養基均為自制。1)牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏1.5 g，蛋白胨2.5 g，NaCl 2.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容1 000 mL，pH 7.2。2) 休和利夫森二氏培養基：蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO40.2 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL，1%溴麝香草酚藍水溶液3 mL，調節pH 7.0～7.4。3) 葡萄糖蛋白胨培養基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，K2HPO45 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.4，每管分裝4～5 mL。4) PDA培養基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，2%瓊脂，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.1.3 試劑 二氧化氯消毒劑，夏縣瑤臺生物科技有限公司；40%克霉靈可濕性粉劑，湖北隨緣食用菌消毒劑有限公司；二氯異氰尿酸鈉消毒劑，威島生物公司；50%多菌靈可濕性粉劑，運城市應用化學廠；新潔爾滅，德州德新康消毒制品有限公司。

1.1.4 儀器設備 VD-650超凈工作臺，上海力辰儀器科技有限公司；HAD-303A-4恒溫培養箱，北京恒奧德儀器儀表有限公司；MiniAmp PCR儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DM500雙目生物顯微鏡，沈陽利昂科技有限公司；CLG全自動高壓滅菌鍋，致微廈門儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理

1) 樣品采集。試驗用污染菌包于2017年2—4月分3批隨機取自陜西省瑞福興生物科技有限公司的發菌室，被雜菌污染的菌包外觀可見明顯的病變癥狀(圖1)。

注：1～4，受污染的海鮮菇菌包；5，正常的海鮮菇菌包。

Note: 1～4，contaminatedH.marmoreusfungus packs；5，normalH.marmoreusfungus pack.

圖1海鮮菇受污染的菌包樣品

Fig.1 Samples of contaminatedH.marmoreusfungus packs

2) 抗菌藥劑PDA平板制備。將二氧化氯消毒液、二氯異氰尿酸鈉、克霉靈、多菌靈和新潔爾滅溶液稀釋成50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL后，分別將其與PDA培養基混勻，制成終濃度分別為50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL的PDA平板備用，以不添加抑菌劑的PDA平板為對照。

1.2.2 污染細菌的分離與鑒定

1) 分離純化。對污染菌包表面殺菌消毒，切開菌包的發病部位，取污染菌料放入裝有滅菌雙蒸水的試管中，震蕩形成懸濁液，依次稀釋成10倍、100倍和1 000倍等不同濃度后，取適量接種到牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培養12 h后，觀察平板上菌落的生長情況。挑出大小、形態、顏色、表面光澤度、透明度和質地不同的菌落，用劃線平板法接種到新的牛肉膏蛋白胨平板培養基上進行純化，并采用柯赫法則進行驗證，每天觀察接種海鮮菇菌包的發病情況至菌包外觀可見明顯病變時結束，并按照上述方法重新分離純化。

2) 革蘭氏染色和生理生化鑒定。先觀察平板上細菌菌落特征，再進行革蘭氏染色顯微鏡鏡檢，然后分別接種于休和利夫森二氏培養基、葡萄糖蛋白胨培養基和牛肉膏蛋白胨培養基(含2%、5%和8% NaCl)測定葡萄糖氧化發酵作用，乙酰甲基甲醇試驗(V.P.試驗)及耐鹽性和需鹽性，并記錄結果[22]。

3) 16S rDNA分子鑒定。提取各細菌菌株的基因組DNA進行PCR擴增。PCR擴增所用引物為細菌通用引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA

G-3’和5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR擴增后產物委托華大基因進行純化和序列測定。測序結果與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比較，得到一系列具有一定相似性的16S rDNA序列。下載GenBank數據庫中同源性較高的16S rDNA序列與該試驗所得細菌的16S rDNA序列對比，確定種屬，并利用MEGA 5.10的鄰近相鄰法計算菌株間的遺傳距離，構建系統發育樹。

1.2.3 抗菌藥劑的篩選 采用單因素試驗，每個藥劑處理濃度均分別為0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L。

1) 對污染細菌的抑制作用。用滅菌的直徑0.6 cm打孔器在牛肉膏蛋白胨培養基平板上均勻打3個孔，用移液槍吸取稀釋成不同濃度梯度的抑菌藥劑100 μL加到孔中，然后將各污染細菌菌液接種于牛肉膏蛋白胨平板培養基上，涂抹均勻，37℃培養12 h后測量抑菌圈直徑大小并分析抗菌藥劑的作用效果及相關范圍。3次重復。

2) 對海鮮菇菌絲生長的抑制作用。在海鮮菇菌絲的PDA平板上，用打孔器取菌齡相同的菌塊(直徑0.6 cm)接種于抗菌藥劑PDA平板中央位置，25℃避光培養72 h后，采用十字劃線法測量菌絲生長速度。根據菌絲生長速度分析抗菌藥劑對海鮮菇菌絲生長的抑制作用。3次重復。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 污染細菌的分離鑒定

2.1.1 污染細菌的菌體形態特征和生理生化特性 從表1看出，試驗共分離純化得到6株污染細菌，分別標記為XRA1、XRA2、XRA3、XRB1、XRC1和XRC2。其中，XRA1、XRA2、XRA3和XRB1革蘭氏染色為革蘭氏陽性細菌(G+)，XRC1和XRC2為革蘭氏陰性細菌(G-)；除XRC2菌體形狀為球狀外，其余菌體形態均為桿狀；菌落透明度低，為半透明至不透明；菌落形狀XRA1和XRA2為不規則形，其余為圓形且多凸起，顏色各異。從表2看出，將分離到的污染細菌菌株接到相應的生理生化培養基中培養24～48 h后，所有菌株均具有運動性，可發酵葡萄糖，但只有XRA3產氣；XRA1、XRA2、XRA3和XRC1在5% NaCl溶液中仍能正常生長，在8% NaCl溶液中6株菌株均不能正常生長。將分離純化的細菌回接到健康海鮮菇菌包，48 h后開始出現相同污染癥狀；再次對污染細菌進行分離純化培養，鑒定細菌為最初海鮮菇的污染菌，符合柯赫法則。

2.1.2 16S rDNA鑒定 6株污染細菌分別用細菌通用引物進行PCR擴增，結果均出現1條大小約1 500 bp較清晰的條帶(圖2)，與預期值相符，可用于后續測序工作。

表2 海鮮菇污染細菌的生理生化特性

注：“+”表示反應為陽性；“-”表示反應為陰性。

Note：“+”and “-”represent positive and negative reactions，respectively.

注：M，DL2000 Marker; 1～6，PCR擴增產物。

Note：M，DL2000 Marker; 1～6，PCR products.

圖2海鮮菇污染細菌16S rDNA的PCR擴增產物電泳

Fig.2 Electropherogram of PCR products of 16S rDNA ofH.marmoreuspathogenic bacteria

2.1.3 構建系統發育樹 從圖3可見，XRA1與芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、XRA2與萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、XRA3與微小桿菌屬(Exiguobacteriumsp.)、XRB1與嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、XRC1與粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、XRC2與糞產堿菌(Alcaligenesfaecalis)的同源相似性分別為98%、99%、98%、98%、98%和98%。結合形態學特征和生理生化特性可以初步得出XRA1、XRA2、XRA3、XRB1、XRC1和XRC2分別屬于芽孢桿菌屬、萎縮芽孢桿菌、微小桿菌屬、嗜熱脂肪芽孢桿菌、粘質沙雷氏菌和糞產堿菌。其中，XRA1和XRA3經過比對目前只鑒定到屬。

圖3海鮮菇污染細菌菌株基于16S rDNA序列構建的系統發育樹

Fig.3 Phylogenetic tree ofH.marmoreuspathogenic bacteria based on 16S rDNA sequence

2.2 海鮮菇污染細菌抗菌藥劑的篩選

2.2.1 抗菌藥劑對病原細菌的抑菌作用 從表3可見，5種抑菌劑對各病原細菌菌株的影響差異較大，其抑制作用均隨處理濃度增加而增強；其中，二氧化氯、二氯異氰尿酸鈉和新潔爾滅對污染細菌的抑制作用較強，在低濃度(50 mg/L)時對所有細菌的抑制作用均與對照差異顯著；克霉靈和多菌靈對污染細菌的抑制作用較弱，在低濃度(50 mg/L)時對大部分細菌的抑制作用與對照無顯著差異，高濃度(200 mg/L)時對部分細菌的抑制作用仍與對照無顯著差異。

2.2.2 抗菌藥劑對海鮮菇菌絲生長的抑制作用 從表3可見，5種抑菌劑對海鮮菇菌絲生長的抑制作用均隨處理濃度增加而增強；在低濃度(50 mg/L)時對海鮮菇菌絲生長的影響處理間及與對照間均無顯著差異。當處理濃度>50 mg/L時，對海鮮菇菌絲生長的影響均與對照存在顯著差異。相同處理濃度二氧化氯、二氯異氰尿酸鈉和新潔爾滅的抑制作用均較克霉靈和多菌靈強。

綜上，海鮮菇工廠化生產中可以考慮使用較低濃度(50 mg/L)的二氧化氯、二氯異氰尿酸鈉和新潔爾滅抑制雜菌生長，為減少抗藥性的發生可選擇三者交替使用。

表3 抑菌劑對病原細菌及海鮮菇菌絲生長的抑制作用

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters in the same column indicate 5% significant level.

3 結論與討論

在海鮮菇工廠化生產的各個階段均會受到病原菌的侵染，其中培養料受污染影響最為嚴重。海鮮菇栽培中，病原菌可以通過空氣、滅菌不徹底的培養料、帶菌的操作環境引入。此外，菇蠅等害蟲可能攜帶有病菌，由此造成病害的侵染傳播。

研究首次針對海鮮菇工廠化生產中污染菌包的細菌進行調查分析，共分離得到污染細菌6株，通過形態學、生理生化及分子生物學鑒定，確定其分別為芽孢桿菌屬、萎縮芽孢桿菌、微小桿菌屬、嗜熱脂肪芽孢桿菌、粘質沙雷氏菌和糞產堿菌，其中，有2株細菌只鑒定到屬。污染細菌的種類多樣，也給海鮮菇生產中細菌病害的防治帶來一定的難度。

目前，在海鮮菇的實際生產中，除了盡量減少細菌污染的可能，抗菌藥劑的使用已成為防治食用菌雜菌污染的主要方法之一。研究結果表明，二氧化氯消毒液、二氯異氰尿酸鈉、40%克霉靈可濕性粉劑、新潔爾滅和50%多菌靈可濕性粉劑5種殺菌劑對上述幾種細菌生長均有抑制作用，但效果存在很大差異。低濃度(50 mg/L)的二氧化氯消毒液、二氯異氰尿酸鈉和新潔爾滅對各污染細菌均有較好的抑制作用，且對海鮮菇菌絲生長影響較小，在生產上可選擇三者交替使用，以降低菌株抗藥性的風險。

試驗只對比分析5種抑菌藥劑對細菌和海鮮菇菌絲生長的抑制，對海鮮菇孢子萌發的抑制作用、不同細菌對海鮮菇致病性差異及治病機理等均未涉及，還有待進一步研究。另外，該試驗濃度是否適合生產中使用，對實際生產海鮮菇的產量、品質是否有影響，是否有農藥殘留超標，以及實際應用效果等尚待生產檢驗。